李 壮 张 鹏 孙艳军 盛明辉 王文飞 孙登群,

1 安徽中医药大学第一临床医学院，安徽省合肥市 230022； 2 武警安徽省总队医院普外科

胆囊癌(Gallbladder cancer,GBC)是一种常伴有局部浸润、早期广泛的淋巴结转移和多发性远处转移的侵袭性疾病。由于没有具体的临床体征、症状或可靠的敏感标记，出现的症状常被误诊为胆绞痛或慢性胆囊炎，进一步延误诊断。对于晚期GBC患者，需要联合化疗、放疗、靶向治疗和免疫治疗，以提高患者的总生存率，通常晚期患者因癌细胞远处转移难以根治性切除而疗效欠佳,故其患者总体预后极不理想。因此识别新的生物标志物对于GBC患者的早期诊断和有效治疗至关重要。据资料显示microRNA能调节人类1/3的基因，microRNA与肿瘤细胞的发生亦有非常密切的关系，许多研究发现改变miRNAs的表达与癌症进展有关，其中包括GBC[1]。因此深入探寻miRNA对GBC发生发展的相关性对突破现阶段GBC的诊疗治疗有重要意义。

1 MicroRNA 的概述

MicroRNAs(miRNAs)是一种短的(19～25个核苷酸)非编码RNA，起着基因表达的主要调节作用，调节人类1/3的基因[2]。到目前为止，被鉴定出的miRNA已经高达上万个，并被证明参与调节各种生物学过程以及众多的发育和生理过程。这些基因主要通过与靶mRNA的3’非翻译区(UTR)结合，作为转录后基因表达的负调控因子，从而要么在转录上破坏/降解，要么抑制(或两者兼而有之)，这取决于miRNA-mRNA的互补程度[3]。

一般来说，miRNAs参与了重要基因的转录调控，这些基因控制着肿瘤发生和发展中的关键信号通路，如凋亡、细胞增殖、血管生成和微环境的调节。各种研究表明miRNAs基因调控影响与多种信号通路有关，如p53、HIF-1α、RAS、AKT、AMPK和cMyc等导致癌症代谢缺陷的信号通路。研究还发现，miRNA在人类肿瘤中的表达普遍下调，而一些研究也报道了miRNA在癌症中的过度表达[4]。此外，研究发现miRNA既可以作为癌基因，也可以作为肿瘤抑制因子。由于miRNA在体液中稳定表达,且检测miRNA水平日趋精准，miRNA的表达有助于作为癌症患者诊断、预后和治疗选择的新的肿瘤生物标志物[5]。

2 MicroRNA调控相关通路参与胆囊癌的发病

胆囊癌的形成是一个多阶段的过程，在接触致癌物后，正常胆囊上皮由化生到异型增生再到原位癌，最后转化为浸润性癌。整个致癌过程是缓慢的，可能需要长达15年的时间。在分子水平上，恶性转化是由于某些基因突变随时间聚集而发生的，因此原癌基因和抑癌基因、不同的信号通路等多方面下影响着胆囊癌的进展。

2.1 PTEN/PI3K/Akt信号通路 PTEN是一种具有脂质和蛋白双重磷酸酶活性的肿瘤抑制因子，可负向调节AKT信号通路，抑制肿瘤细胞的增殖与迁移，且PTEN/PI3K/AKT信号通路参与调控多种肿瘤细胞迁移与侵袭[6]。Chen等[7]研究发现肿瘤细胞中miR-205、miR-122、miR-21的表达能够抑制PTEN的表达，促进肿瘤的增殖、生长和转移。miR-99a-5p在胆囊癌患者组织中普遍低表达，体内体外实验证明过表达miR-99a-5p能使Akt蛋白的酸磷化水平下降，抑制PI3K/Akt信号通路[8]。Xuan等[9]探讨了ORA(黄芩素A)对PTEN/PI3K/AKT信号通路的影响，发现ORA可抑制PTEN/PI3K/AKT信号通路，进而影响胆囊癌GBC-SD的进展。进一步研究证明ORA在体内能抑制胆囊肿瘤的生长。这些结果表明ORA可能在不久的将来成为一种潜在的抗肿瘤药物用于人类胆囊癌的治疗。

2.2 c-FLIP信号通路 c-FLIP是一种重要的参与细胞凋亡的抑制蛋白，Zong等[10]研究发现miR-125b在胆囊癌组织中的表达明显降低，miR-125b的表达与胆囊癌的分级显著相关(P=0.036 1)。miR-125b通过与c-FLIP mRNA的3’端非编码区相互作用而抑制c-FLIP的表达从而起到抑制胆囊癌细胞的生长，揭示了miR-125b-c-flip信号在胆囊癌细胞生长中的重要作用。c-FLIP丰富了miR-125b的靶基因通路，有望成为治疗GBC的新靶点。

2.3 Notch信号通路 研究发现，Notch信号异常与恶性肿瘤的发生发展有着广泛而密切的关系，并可根据组织或细胞类型的不同具有致癌或肿瘤抑制功能。已确定4个Notch受体(Notch 1～4)和5个Notch配体在Notch信号通路中发挥作用[11]。Hua等[12]研究表明miR-1-5p在胆囊癌组织中的表达明显低于非肿瘤组织，体外实验表明miR-1-5p可抑制胆囊癌细胞的增殖、集落形成、迁移和侵袭。miRNAs通过抑制靶基因的表达发挥其关键作用，Notch2是miR-1-5p的直接靶基因，miR-1-5p通过靶向Notch2的表达在胆囊癌细胞中发挥肿瘤抑制作用，并为miR-1-5p/Notch2信号在人胆囊癌细胞生长、迁移和侵袭中的精确表达提供了分子基础。

2.4 ANGPT2信号通路 Diao等[13]通过免疫组织化学和逆转录—定量PCR检测发现miR-135a-5p在GBC组织中表达下调, 过表达显著抑制GBC-SD细胞的增殖和迁移。从荧光素酶活性检测发现血管生成素-2(ANGPT2)是GBC中miR-135a-5p的潜在靶基因，抑制ANGPT2表达可显著抑制胆囊癌的增殖、迁移和侵袭。因此miR-135a-5p可能是GBC进展的潜在生物标志物和GBC治疗干预的潜在靶点。

2.5 JAK/STAT信号通路 信号转导和转录激活因子(STAT)被Janus激酶(JAK)磷酸化、二聚化，然后通过核膜转运到细胞核，调节相关基因的表达。该通路被称为Janus激酶/信号转导和转录激活因子(JAK/STAT)信号通路，又称IL-6信号转导通路，是近年来发现的一种细胞因子刺激的信号转导通路。该信号通路与多种机体功能相关，并参与一些重要的生物学过程，包括细胞增殖、分化、凋亡、免疫调节。Ishigami等[14]研究发现miR-31在胆管癌组织中的高表达，miR-31高表达与预后显著相关(P=0.043)，miR-31在肿瘤组织中表达上调，它不仅促进细胞增殖，而且抑制凋亡。IL-6受体是信号转导和转录激活因子3(STAT3)的强诱导因子，lL-6的STAT3信号是癌细胞增殖和存活的重要促进剂。miR-31的靶基因位点STAT-3结合位点，抑制STAT-3信号转导显著抑制miR-31的表达和细胞增殖。结论：IL-6-STAT-3信号转导调控胆管癌细胞增殖和miR-31表达,提示miR-31可能是一个很有前途的生物标志物。

2.6 EMT信号通路 上皮细胞—间充质转化(Epithelial-tomesenchymal transition，EMT)是介导包括胆囊癌在内的多种癌症恶变的关键步骤，miRNA可以通过抑制EMT发挥抑癌作用。Lu等[15]研究发现在胆囊癌组织中miR-7-2-3p和miR-29c-3p的水平明显降低，miR-7-2-3p和miR-29c-3p的过表达明显削弱了癌细胞的迁移和侵袭能力。实验检测胆囊癌细胞中miR-7-2-3p和miR-29c-3p的Vimentin表达降低，E-cadherin表达增强。MiR-7-2-3p和miR-29c3p过表达通过逆转EMT表型，在体内外抑制GBC转移。Cui等[16]采用定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)方法检测发现miR30-b和miR-30d在胆囊癌组织中的表达水平均低于正常胆囊组织。miR-30b模拟、miR-30d模拟和miR-30b/-30d模拟引入GBC-SD细胞，并检测了EMT特异性标记物E-cadherin、N-cadherin和visionin的表达，这在miR-30b模拟、miR-30d模拟和miR-30b/-30d模拟处理的人GBC细胞中表现为E-cadherin增强，N-cadherin和vientin减少。结果提示miR-30b/-30d 能够抑制GBC-SD的EMT和侵袭迁移。

3 MicroRNA诱导基因受体在胆囊癌中的作用机制

除了通路改变外，miRNA表达失调可能源于肿瘤抑制因子或致癌因子的改变，这些肿瘤抑制因子或致癌因子作为转录激活因子或抑制因子在肿瘤性疾病的起始、进展和转移中起到致癌基因或抑癌基因的作用。

3.1 miRNA致癌的作用机制 Tong等[17]发现与邻近组织相比，胆囊癌组织中miR-197高表达，下调增殖相关蛋白p-ERK1/2和p-AKT的表达，上调凋亡途径相关蛋白Bax/Bcl-2和c-caspase-3的表达，从而促进了胆囊癌细胞的增殖、迁移和侵袭。Song等[18]研究发现miR-552-3p在胆囊癌组织中表达上调，miR-552-3p在体内外实验证明可促进GBC细胞的增殖、迁移和侵袭。重要的抑癌基因RGMA被确定为miR-552-3p的靶点，miR-552-3p通过直接靶向RGMA的3’-UTR区域，负调控GBC中RGMA的表达。miR-552-3p通过抑制肿瘤抑制基因RGMA，导致Akt/β-catenin和EMT信号通路的重新激活而促进胆囊癌的恶性进展。miR-552-3p可作为GBC患者预后的预测指标和治疗靶点。

3.2 miRNA抑癌的作用机制 文献[4]报道miRNA可通过调节下游特定靶基因抑制肿瘤细胞侵袭和增殖。Gong等[19]研究发现miR-1231在胆囊癌组织中的表达水平低于癌旁组织。miR-1231低表达的GBC患者肿瘤分期差，肿瘤体积较大，过表达降低了GBC细胞的增殖能力，miR-1231抑制GBC增殖并诱导其凋亡。miRNAs和靶基因之间相互作用可以影响病理进展，经测定FOXC2为miR-1231结合靶基因，FOXC2水平被负调控，miR-1231通过下调FOXC2，从而减轻GBC的恶性发展。Jiang等[20]研究发现miR-365在胆囊癌组织中表达下调，抑制胆囊癌细胞的生长、转移和自我更新，实验结果表明miR-365在胆囊癌中可能起到抑癌作用。Li等[21]研究发现miR-188-5p在胆囊癌组织中表达下调，miR-188-5p过表达可诱导GBC细胞凋亡,同时miR-188-5P抑制剂转染后凋亡细胞减少。在总体生存期方面，miR-188-5p低表达患者的预后明显差于miR-188-5p高表达患者。划痕实验转染miR-188-5p的NOZ细胞侵袭细胞数量减少，而miR-188-5p下调则增强了GBC-SD细胞的侵袭能力。这些数据表明miR-188-5p具有抗肿瘤特性，可以抑制GBC的迁移和侵袭。

4 MicroRNA在诊断评估胆囊癌中的相关研究

microRNA在胆囊癌诊断和预后评估中具有重要的价值意义。血清等标本容易获取，且其中的miRNA稳定，因此为miRNA作为胆囊癌的一种肿瘤标志物进行临床检测提供了可能性。Li等[22]通过比较GBC组织和癌旁正常组织中miRNAs的差异表达，使用MiRNA微阵列分析评估40例胆囊癌患者外周血样本中全基因组miRNA的表达，进一步在血浆中验证miRNA21、miRNA187、miRNA143、miRNA202、miRNA335、let7a在胆囊癌患者血浆中的表达异常，对胆囊癌诊断具有重大临床意义，对制定治疗方案和预后判断起到重要作用。血浆中miRNA特异表达谱可能是诊断胆囊癌一类新的血液肿瘤标志物,通过对血浆中特异性miRNA表达谱的检测来早期诊断胆囊癌，评估其转移和复发，可以弥补癌胚抗原(CEA)和糖类抗原19-9(CA19-9)早期诊断敏感性低的不足。Gupta等[23]评估了GBC中分子标记物的表达，实验证明p53是最常见的阳性标记占74%，survivin占58%，COX-2(Cyclooxygenase-2)占44%，p16占42%，而Her 2-neu(Human epidermal growth factor receptor 2 )和EZH-2(Enhancer of zeste homolog-2)各占16%，不同分期的p16和p53分布差异有统计学意义(χ2= 7.017,P= 0.037；χ2= 5.861,P= 0.033)。研究结果提示GBC中存在Her 2-neu、p53、p16、survivin、COX-2、ezh-2等分子标志物的表达，今后可用于疾病的早期检测和靶向治疗。胆汁是胆管上皮细胞赖以生存的微环境，在脂肪代谢中发挥重要的作用。有研究显示，胆汁外泌体中miR-191、miR-486-3p、miR-1274b、miR-16和miR-484 5种miRNA可作为胆管癌诊断组合，灵敏度和特异度分别为67%和96%，优于血清糖类抗原19-9(CA19-9)检测[24]。胆汁外泌体在疾病诊断中发挥重要作用，相对于其他体液，有关胆汁外泌体的研究较少，外泌体中所含遗传信息及其相关作用机制有待进一步深入。

此外，有研究结果鉴定microRNA可作为胆癌患者诊断和预后评估的生物标志物是有应用前景的。Wang等[25]使用微阵列技术来鉴定长期或短期生存的GBC患者中调节异常的miRNAs。与正常胆囊癌组织相比，长期生存的GBC患者癌组织中有104个miRNAs表达异常，短期生存的GBC患者癌组织中有124个miRNAs表达异常。随后通过Venn图分析，发现只有hsa-miR-142-5p和hsa-miR-146b-5在长期生存的GBC患者中表达下调，而22个miRNAs在短期生存的GBC患者中完全表达异常，说明这些miRNAs可能与GBC患者的生存有关，提示它们可能是诊断胆囊癌预后的新指标。这些临床对照研究实验证实，miRNA在胆囊癌患者与健康人群之间存在显著差异性表达，这为miRNA成为胆囊癌潜在诊断标志物奠定了理论基础。

5 小结与展望

胆囊癌的发病率近几十年来呈上升趋势，迫切需要研究新的诊断和预后生物标记物以及确定胆囊癌的潜在发病机制。目前miRNA已在多种肿瘤中发现其异常表达，要弄清miRNA在胆囊癌中的价值，还需要通过进行更多的相关研究来进一步探索它们。因此，在后续的研究中，笔者将继续关注miRNA在胆囊癌中的相关研究进展，以证实其临床应用的可靠性。