于会丽，徐变变，徐国益，邵 微,2，高登涛，司 鹏

（1中国农业科学院郑州果树研究所，郑州 450009；2河南农业大学林学院，郑州 450002）

0 引言

生物有机肥含有功能菌，功能菌的快速繁殖可优化土壤微生物种群结构，增强土壤酶活性，活化土壤养分[1]，提高根系活力[2]，促进根系对营养元素的吸收利用[3]，提高作物产量和品质[4-5]，增强作物抗病和抗逆性[6-7]。如曹亮亮等[8]发现在腐熟鸡粪堆肥中添加2种蛋白原料固态发酵根际功能菌研制成的生物有机肥，均能显著增加盆栽香蕉植株的株高和假茎粗。陈波等[9]研究表明，生物有机肥较对照及有机肥处理，显著促进了盆栽樱桃树体对氮、磷、钾的吸收。艾尔买克·才卡斯木等[10]通过盆栽试验发现，不同氯化钠浓度胁迫下，实生核桃幼苗接种EM菌，核桃幼苗生物量和超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)活性均显著高于非菌根植株，而叶片丙二醛(MAD)含量显著低于非菌根植株。同时邵丽等[11]采用Biolog-Eco法研究表明，生物复混肥能显著提高土壤微生物群落碳源利用率、微生物群落丰富度和功能多样性。孙薇等[12]利用Biolog-Eco技术分析了不同施肥处理对土壤微生物群落代谢能力的影响，结果表明，生物有机肥处理土壤微生物活性、物种多样性、丰富度以及对6类碳源代谢能力均显著高于常规施肥。然而生物有机肥在促进盆栽苹果幼苗生长、抗逆指标以及对土壤微生物多样性影响的有关报道仍较少。

本研究以1年生苹果幼苗‘烟富8号’为试材，以常规有机肥鸡粪为对照，研究生物有机肥不同施用量对苹果幼苗生长、生理特性以及土壤微生物功能多样性的影响，确定其在树苗栽培中最佳施用量，以期为生物有机肥在苗木培育中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验地基本情况

试验于2017年4月在中国农业科学院郑州果树研究所试验田进行。区域气候为温带大陆性季风气候，年平均降雨量632 mm，无霜期220天，全年日照时间约2400 h。

1.2 供试材料

供试作物为1年生苹果幼苗‘烟富8号’。

供试肥料包括生物有机肥（有效活菌数≥2亿个/g，有机质≥70%，氨基酸≥20%，腐殖质≥40%，N+P2O5+K2O≥6%）和鸡粪（有机质≥50%，N+P2O5+K2O≥6%）。

1.3 试验设计

试验以盆栽方式进行，采用内径31 cm、高38 cm的圆筒塑料盆，每盆装风干土20 kg。试验共设4个处理，CK为鸡粪35 g/(kg·土)，T1、T2、T3分别为生物有机肥23.3、35、70 g/(kg·土)，其中，23.3、35、70 g/(kg·土)指供试肥料中折算出有机含量与土壤质量比值，每处理重复3次，每重复种植4盆，完全随机排列。各处理中土壤与有机肥充分混匀后装盆备用。

1.4 样品采集及测定

1.4.1 株高样品选择 9月收获时，每处理每重复选择生长一致的‘烟富8号’苹果幼树进行测定。

1.4.2 叶片样品采集 9月收获时，每株采取枝条倒2～4片叶，一部分叶片带回实验室立即测定鲜重、叶面积、叶片SPAD值，后烘干粉碎用于测定叶片中氮磷钾含量；一部分叶片用冰盒带回实验室并保存于4℃冰箱中用于测定叶片抗性物质和酶活性等指标。

1.4.3 土壤样品采集 每处理每重复选择4株树以抖落法[13]采集果树根际土壤样品，去除植物残根等杂物后，并将4个土样混合，过2 mm孔径的无菌筛网，-80℃储存。

1.4.4 根系样品采集 将去除土壤的根系放于0.149 mm的筛中，用水冲洗干净，取出杂物、死根后，将根系用吸水纸吸干后保存，用于测定根系的各项指标。

1.4.5 样品测定 株高用直尺测量植株从露出土壤根部至顶端的距离，叶面积采用便携式叶面积仪CI-203CA测定，主根长采用直尺测定，根体积采用排水法测定[14]，叶片SPAD值采用SPAD-502仪测定，叶片可溶性糖采用蒽酮比色法测定[15]，叶片可溶性蛋白采用考马斯亮蓝G-250染色法测定[15]，叶片丙二醛(MDA)采用硫代巴比妥酸(TBA)法测定[14]，叶片脯氨酸采用磺基水杨酸法测定[14]，叶片POD（过氧化物酶）、CAT（过氧化氢酶）和PAL（苯丙氨酸解氨酶）活性方法参见文献[16]，采用H2SO4和H2O2消煮，全自动间断化学分析仪（Clever Chem 380，德国）测定叶片氮和磷含量，火焰光度计测定叶片钾含量[17]。

1.4.6 土壤微生物群落测定 将相当于1 g烘干土的新鲜土壤加入到盛有99 mL 0.85%灭菌生理盐水的250 mL三角瓶中，28℃、200 r/min条件下振荡培养30 min，使土样与生理盐水充分混匀，再放置在4℃冰箱内静置30 min，然后加样于Biolog-Eco板微孔板中，每孔加入150 μL。25℃下培养192 h，每24 h Biolog自动读取仪读数1次（Biolog MicroStation自动微生物鉴定，美国）。Biolog-ECO 96孔微平板上分布31种单一碳源和空白对照，每种碳源和空白有3个平行。31种单一碳源大致可分为6类（碳水化合物、氨基酸类、羧酸类化合物、聚合物、胺类化合物和酚酸类化合物），并以各类碳源在96 h的相对光密度(Ci-R)平均值表示土壤微生物对这一碳源的利用强度。一个板可以测3个平行。

微生物群落功能多样性的计算[18]如式(1)～(5)。

Mc Intosh指数(U)是基于群落物种多维空间距离的多样性指数，可利用第i孔的相对吸光值(ni)计算得到[式(1)]。

Shannon-Wiener指数(H')用于评估丰富度，其中Pi为第i孔的相对吸光值与整个平板相对吸光值总和的比例，如式(3)。

式中，Ci为所测定的31个碳源孔的吸光值，R为对照孔的吸光值。

Simpson指数(D)又称优势度指数，是对多样性方面的集中性度量[式(4)]。

Pielou均匀度指数(E)是群落实测多样性与最大多样性的比例[式(5)]。

式中，S为丰富度指数，代表被利用的碳源总数。

1.5 数据整理与分析

采用Microsoft Excel 2010进行数据处理；用SPSS 17.0统计软件进行方差分析，对苹果幼苗生物量（株高、叶面积、百叶鲜重、根体积、根长）、叶片生理特性（丙二醛、可溶性蛋白、可溶性糖、脯氨酸、过氧化物酶、过氧化氢酶、苯丙氨酸解氨酶、SPAD值、叶片氮、磷、钾）、土壤微生物群落多样性指数（均匀度指数、优势度指数、多样性指数、丰富度指数、均一性指数）、土壤微生物对6类碳源的利用强度（聚合物、碳水化合物、酚酸类化合物、羧酸类、氨基酸类、胺类）用SPSS 17.0统计软件进行主成分分析。分析中，一般选择特征值大于1的成分作为主成分。本研究数据分析中，特征值大于1的有3个成分，分别记作F1、F2、F3。这3个主成分的累计贡献率为100.00%，表示这3个主成分涵盖了所有的原始数据信息。每个处理的综合得分按照式(6)计算。

2 结果与分析

2.1 生物有机肥对苹果苗生物量的影响

如表1所示，与CK相比，生物有机肥处理增加苹果苗株高和根长，其中，T1处理的株高和根长最高，较CK分别显著增加14.24%和24.02%，且T1处理与其他处理差异显著。生物有机肥处理的苹果幼苗叶面积和百叶鲜重均低于CK，其中T3处理的叶面积和百叶鲜重最低，较CK分别显著降低12.78%和23.85%，其他处理与CK差异不显著。除T1处理外，生物有机肥处理的苹果幼苗根体积均显著低于CK。

表1 不同处理对苹果幼苗生物量的影响

2.2 生物有机肥对苹果叶片生理特性的影响

2.2.1 生物有机肥对苹果叶片抗性物质的影响 由表2可以看出，施用不同浓度生物有机肥对苹果叶片抗逆性指标影响各异。与CK相比，T1处理的苹果叶片可溶性糖和脯氨酸含量最高，丙二醛含量最低，除可溶性糖外，差异达显著性水平。生物有机肥处理的苹果叶片可溶性蛋白含量均低于CK，其中T1和T3处理叶片可溶性蛋白较CK分别显著降低19.65%和26.39%。

表2 不同处理对苹果叶片抗性物质的影响

2.2.2 生物有机肥对苹果叶片酶活性和SPAD值的影响 由图1可知，T1处理下，苹果叶片过氧化物酶和苯丙氨酸解氨酶活性达最高，较CK分别增加5.84%和5.48%，差异不显著；与CK相比，T2处理显著提高苹果叶片过氧化氢酶活性，其他处理与CK无显著差异；T3时处理下，苹果叶片过氧化物酶、过氧化氢和苯丙氨酸解氨酶活性达最低。由此表明，低用量生物有机肥可促进叶片酶活性，高用量抑制叶片酶活性。苹果叶片SPAD值由高到低依次为T1＞T2＞T3＞CK，其中，T1和T2处理苹果叶片SPAD值较CK分别显著提高15.45%和12.71%，T3处理与CK差异不显著。

图1 不同处理对苹果叶片过氧化物酶、过氧化氢和苯丙氨酸解氨酶活性以及SPAD值的影响

2.2.3 生物有机肥对苹果叶片氮、磷、钾含量的影响 生物有机肥对苹果叶片氮、磷、钾含量的影响如图2。结果表明，T1和T3处理苹果叶片氮含量较CK分别增加2.58%和7.79%。同时生物有机肥显著提高苹果叶片钾含量，钾含量由高到低依次为T1＞T2＞T3＞CK，T1处理较CK显著增加27.33%，不同处理间差异不显著。但生物有机肥处理对苹果叶片磷含量影响不大。

图2 不同处理对苹果叶片氮、磷、钾含量的影响

2.3 生物有机肥对苹果土壤微生物多样性的影响

2.3.1 不同处理土壤微生物功能多样性指数分析 选取土样培养96 h数据进行土壤微生物代谢多样性分析，不同施肥处理对苹果土壤微生物群落功能多样性指数影响不同，如表3所示。T2处理的土壤优势度指数D、多样性指数H'和丰富度指数S显著低于其他处理，T3处理的多样性指数H'、丰富度指数S和均一性指数U最高，较CK分别提高0.91%、7.60%和4.14%，且与T1处理差异不显著。

表3 土壤微生物群落多样性指数

2.3.2 不同处理土壤微生物对6类碳源的利用强度 由图3可知，施生物有机肥与鸡粪CK土壤微生物对Biolog-Eco板中不同类碳源利用强度存在不同差异。T1处理土壤微生物对酚酸类化合物和胺类利用强度较CK分别增加18.87%和13.51%，且与其他处理无显著性差异；T3处理土壤微生物对聚合物、碳水化合物、氨基酸类和胺类利用强度最高，较CK分别增加20.00%、6.33%、16.88%和18.92%；与CK相比，T2处理土壤微生物对聚合物、碳水化合物和羧酸类利用强度分别降低8.33%、8.86%和21.79%。

图3 不同处理土壤微生物对6类碳源的利用强度

2.4 不同处理对苹果幼苗生长、土壤微生物多样性指数、碳源利用强度综合影响主成分分析

通过主成分分析（表4）可知，第1主成分其特征值的变量解释度为45.345%，是最主要的解释变量，前2个成分的特征值为79.196%，表明这2个成分是主要分析部分。对各处理在3个成分中进行综合评价（表5），T1得分最高，为2.06，说明T1处理苹果土壤微生物功能多样性指数、碳源利用强度及苹果苗生物量、叶片抗性物质、酶活性、SPAD值、养分含量最高。

表4 指标总方差分解

表5 不同处理苹果幼苗综合评价

3 结论

施用生物菌肥可不同程度上增加苹果幼苗株高、根长、叶片钾养分、可溶性糖和脯氨酸含量，影响叶片酶活性，改善土壤微生物功能多样性，其中以施用23.3 g/(kg·土)生物有机肥的效果最好。施用生物有机肥23.3 g/(kg·土)显著提高苹果苗株高、根长和叶片钾养分、脯氨酸和SPAD值，增加叶片酶活性，促进苹果苗生长，施用70 g/(kg·土)生物有机肥反而降低叶片酶的活性；同时，施用23.3 g/(kg·土)生物有机肥增加土壤微生物群落丰富度，提高土壤微生物对酚酸类化合物和胺类利用强度。

4 讨论

4.1 生物有机肥对苹果幼苗生物量和养分含量的影响

生物有机肥含有溶磷、固氮功能的有益微生物，能够改善土壤环境，促进作物生长发育[19]。李北齐[20]研究发现，施用生物有机肥能增加盆栽盐碱土玉米的株高和根长。本研究与其类似，施用生物有机肥均能促进苹果幼苗的株高和根长，其中生物有机肥23.3 g/(kg·土)处理(T1)效果最佳。生物有机肥用量为70 g/(kg·土)处理(T3)对苹果幼苗叶面积、百叶鲜重以及根体积产生抑制作用。可能是由于生物有机肥用量过多，其成分抑制或导致其他元素供应不足，从而抑制苹果幼苗生长[21]。同时本研究发现，生物有机肥可提高苹果叶片氮和钾含量，这与张金妹等[22]的研究结果相似。生物有机肥中的有益微生物菌群具有固氮解钾能力，使土壤养分有效地供应给作物，从而提高氮、钾含量[23]。

4.2 生物有机肥对苹果叶片生理特性的影响

丙二醛是植物在逆境环境下细胞发生膜脂过氧化作用的产物之一，其含量反映植物遭受逆境的伤害程度[24]。本试验结果表明，与鸡粪CK相比，施用生物有机肥能够显著降低苹果叶片丙二醛含量，即降低苹果叶片膜脂质过氧化程度，预防并修护叶片细胞和细胞膜损伤，增强植株生长代谢活力，这与刘艳等[25]的研究结果相似。脯氨酸是植物体内一种细胞质渗透调节物质，植物在逆境环境下体内脯氨酸含量发生改变[25]。本研究发现，生物有机肥低浓度23.3 g/(kg·土)处理叶片脯氨酸含量显著高于高浓度70 g/(kg·土)处理，可能是高浓度生物有机肥胁迫下细胞受害严重，导致叶片脯氨酸含量减少[26]。植物体内防御酶活性与植物抗性相关，生物有机肥增强草莓抗逆性[27]。本研究表明，生物有机肥能提高叶片过氧化氢酶(CAT)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性，增强幼苗抗逆性，这与谢东锋等[28]研究结果相似。同时发现，生物有机肥低浓度23.3 g/(kg·土)处理时3种酶活性增加，高浓度时70 g/(kg·土)处理酶活性降低，这可能与处理叶片丙二醛含量有关（表2），即丙二醛含量降低，酶活性增加，丙二醛含量的积累对酶活性增加具有诱导作用[29]。

4.3 生物有机肥对土壤微生物多样性的影响

笔者用Biolog-Eco方法研究了施用生物有机肥对土壤中微生物群落代谢的影响，结果表明，施用生物有机肥平均能增加土壤微生物多样性指数以及微生物对6类碳源的利用强度，可能是生物有机肥的施用改善了土壤水分、营养、通气等环境条件，为土壤微生物提供良好的生长环境，提高了土壤微生物代谢能力，增强了土壤微生物竞争能力，从而提高土壤微生物功能多样性以及对6类碳源的利用能力[30-31]，具体作用机理有待进一步研究。