赵 岩，孙震晓*

(北京中医药大学生命科学学院，北京 102488)

二甲双胍作为临床上广泛应用于2型糖尿病患者的药物，研究表明，接受二甲双胍治疗的2型糖尿病患者的癌症发生率和死亡率明显降低[1-3]。近年来，二甲双胍的抗肿瘤功效受到持续关注，越来越多的实验数据表明二甲双胍可以抑制癌细胞的增殖并诱导多种癌细胞凋亡[4-5]。目前的研究表明，二甲双胍的抗肿瘤机制表现在特异性激活单磷酸腺苷依赖的蛋白激酶(adenosine 5′-monophosphate-activated protein kinase，AMPK)，进而影响其下游的信号通路来发挥抗肿瘤的作用[6-7]；诱导肿瘤细胞周期阻滞[8-9]；增强肿瘤细胞对放化疗治疗的敏感性[10]等。

乳腺癌是全球女性发病率最高的癌症之一，其死亡率仅次于肺癌[11]，三阴性乳腺癌(triple negative breast cancer，TNBC)作为其中的一个分型，是指雌激素受体、孕激素受体、人表皮生长因子受体-2表达均为阴性的一类乳腺癌，占所有乳腺癌患者的15%~20%，其生存率要远低于非TNBC患者[12]，主要原因在于该分型的肿瘤细胞具有分化程度低、增殖能力强、易转移、复发率高的特点。目前，化疗仍是临床上采用的主要治疗手段，但化疗耐药性及TNBC本身转移能力强的特点是其治疗中的主要障碍[13]。流行病学研究表明，服用二甲双胍可显著降低糖尿病患者的乳腺癌发病率和死亡率[14]。因此，本研究选择人三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞为研究对象，探讨二甲双胍体外是否对其增殖和迁移有抑制作用，为进一步开展二甲双胍抗三阴性乳腺癌的基础研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

人三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231，由北京中医药大学生物制药系冻存；RPMI 1640培养基、胰蛋白酶购于Gibco公司；青霉素、链霉素溶液购于Amresco公司；MTT购于北京拜尔迪生物技术有限公司；胎牛血清，购于浙江天杭生物科技有限公司；二甲双胍，纯度≥98%，购于北京兰博利德商贸有限公司；细胞培养瓶，细胞培养孔板，8.0μm孔径Transwell小室均购于Corning公司；MCO-18AIC(UV)细胞培养箱购于Sanyo公司；Nikon ECLIPSE TE2000-S倒置相差显微镜，Nikon ECLIPSE TE200正置显微镜购于Nikon公司。

1.2 实验方法

1.2.1 MTT法检测细胞活力将处于对数生长期的肿瘤细胞按每孔1.5×103个接种至96孔板中，置于CO2体积分数为5%、37℃的恒温培养箱中培养24 h。倒置显微镜下观察到细胞贴壁并且生长良好时，加入RPMI 1640完全培养基和含不同浓度二甲双胍(1、2、4 mmol/L)的含药培养基，作用时间分别为48和72 h。到达作用时间后吸去培养基，每孔加入0.5 mg/mL的MTT 100μL，培养箱中孵育4 h，倒去MTT，加入150μL的DMSO震荡使蓝紫色结晶完全溶解，酶标仪在570 nm处检测溶液的吸光度D(570)。按下列公式计算细胞活力[15]。

1.2.2 细胞形态学观察细胞培养同1.2.1。加入RPMI 1640完全培养基和含不同浓度二甲双胍(1、2、4 mmol/L)的含药培养基，作用时间为72 h。倒置显微镜下观察对照组和加药组细胞的生长状态和形态学变化，拍照记录。

4 mmol/L二甲双胍作用MDA-MB-231细胞48 h后收集细胞，离心涂片后自然晾干，无水乙醇固定3 min。Giemsa贮存液与PBS按1∶5混合后离心，取上清滴加在细胞上，染色15~20 min，洗去染液，正置显微镜下观察，拍照记录。

1.2.3 细胞划痕实验取处于对数生长期的肿瘤细胞，以每孔4.8×105个细胞的浓度接种于6孔板中，接种后轻晃细胞培养板使细胞均匀且单层分布，待细胞生长至汇合度达到95%以上时准备划痕。用10μL白色枪头垂直沿着无菌直尺划痕。之后用PBS轻轻洗涤处理孔3次，洗去划下来的细胞，并拍照记录(0 h)。加入含不同浓度二甲双胍的的培养基(2、4 mmol/L)，对照组使用RPMI 1640完全培养基，置于CO2体积分数为5%、温度为37℃的恒温培养箱中培养24 h后拍照。使用ImageJ软件的划痕面积分析模块得到划痕面积S，并按下列公式[16]计算划痕愈合率。

1.2.4 Transwell迁移实验将处于对数生长期的细胞无血清培养过夜，消化离心收集细胞，使用无FBS，含不同浓度二甲双胍(2、4 mmol/L)的RPMI 1640培养基重悬细胞，调整细胞浓度为2×105个/mL，按每孔100μL即2×104个细胞接种至上室，在下室加入600μL含10%FBS的RPMI 1640，置于CO2体积分数为5%、37℃的恒温培养箱中培养。24 h后从细胞培养板中取出Transwell小室，弃去上室培养液，并使用PBS清洗两次，然后用湿棉签擦去膜上层细胞，4%多聚甲醛固定15 min，并用蒸馏水清洗数次以除去残留固定液。将小室置于0.1%结晶紫中染色30 min，用蒸馏水将浮色漂洗干净后于正置显微镜下(40×)拍照(ImageView拍照软件)，使用ImageJ统计膜下层细胞数。按参考文献[17]的方法分析不同处理组对细胞穿膜能力的影响。

1.2.5 统计学方法数据采用IBM SPSS Statistics 20.0统计软件进行分析。细胞活力，划痕愈合率及穿膜细胞数的统计采用单因素方差分析，所有数据均采用±s表示，以α=0.05为检验水准。

2 结果

2.1 二甲双胍对人三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖的影响

2.1.1 二甲双胍对MDA-MB-231细胞活力的影响MTT实验结果见图1，与对照组比较，可见二甲双胍在浓度为1、2 mmol/L时对MDA-MB-231细胞活力无明显抑制作用，在浓度为4 mmol/L作用72 h时可显著抑制MDA-MB-231细胞活力(P＜0.01)，抑制率为(29.83±2.25)%。

图1 二甲双胍作用48和72 h后对MDA-MB-231细胞活力的影响

2.1.2 二甲双胍对MDA-MB-231细胞形态学变化的影响倒置显微镜下观察结果见图2，与对照组相比，发现二甲双胍浓度为1 mmol/L时细胞形态没有发生明显变化；当二甲双胍浓度为2 mmol/L时，视野中变圆的细胞数量明显增加，且细胞密度有所降低；而当二甲双胍浓度为4 mmol/L时，细胞密度明显降低，细胞与细胞间联系减少。结合MTT实验结果，说明二甲双胍明显抑制了MDA-MB-231细胞的增殖。

细胞经Giemsa染色后光学显微镜下观察结果见图3，可见对照组MDA-MB-231细胞形态正常，而4 mmol/L的二甲双胍组部分细胞出现细胞核碎裂现象。

图2 倒置显微镜下观察二甲双胍作用72 h后MDA-MB-231细胞形态学变化

图3 Giemsa染色观察二甲双胍作用48 h后MDA-MB-231细胞的形态学变化

2.2 二甲双胍对MDA-MB-231细胞迁移能力的影响

2.2.1 二甲双胍对MDA-MB-231细胞划痕愈合的抑制作用体外细胞划痕实验结果见图4，与对照组比较，用2、4 mmol/L的二甲双胍处理MDA-MB-231细胞24 h，药物处理组细胞汇合程度明显降低。2、4 mmol/L二甲双胍处理组划痕愈合率分别为(55.76±2.41)%、(52.67±4.48)%，与对照组间的差异均具有统计学意义(均为P＜0.01)。

图4 二甲双胍作用MDA-MB-231细胞24 h后划痕愈合情况

2.2.2 二甲双胍对MDA-MB-231细胞穿膜能力的抑制Transwell迁移实验结果见图5，不同浓度的二甲双胍处理MDA-MB-231细胞24 h后，视野下穿膜细胞数目明显减少。统计结果显示二甲双胍处理MDAMB-231细胞后，与对照组相比发生迁移的细胞数目显著减少，对照组的穿膜细胞数为(99.3±18.9)个，2、4 mmol/L二甲双胍处理组的穿膜细胞数分别为(61.6±1.6)、(51.3±2.6)个，差异均具有统计学意义(P＜0.05)。

图5 二甲双胍作用MDA-MB-231细胞24 h后的穿膜情况

3 讨论

二甲双胍作为临床广泛使用的药物，其治疗2型糖尿病的效果和安全性已得到充分肯定。目前，除了体外实验证明二甲双胍的抗肿瘤功效外，也有研究表明二甲双胍也可以在体内抑制乳腺癌移植瘤小鼠肿瘤的生长[18-19]。本研究选用了迁移能力较强的人三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞为研究对象，首先，结合细胞活力测定和形态观察，确定二甲双胍体外抑制三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖情况，其次，选择合适的药物浓度，通过划痕实验和Transwell实验观察二甲双胍对该细胞迁移能力的影响。结果表明，2、4 mmol/L浓度的二甲双胍可以显著抑制该细胞的迁移能力，但是，二甲双胍是通过何种分子机制调控肿瘤细胞的增殖和迁移，以及对肿瘤细胞转移能力的影响，还需要进一步实验研究阐明。

肿瘤作为一种多因素共同作用引起的复杂疾病，两药或多药联合使用已在临床证明比单药使用抗肿瘤效果更优[20-21]，二甲双胍与其他抗肿瘤药物联合使用逐渐为大家所关注。有实验表明，二甲双胍与醋酸诺美孕酮联合应用时，使子宫内膜癌细胞RL95-2和HEC-1A的增殖抑制率分别提高了12.8%和17.1%[22]。二甲双胍和顺铂联用与分别单用相比可明显降低TNBC细胞的存活率，同时，细胞迁移和侵袭的现象也明显减弱[23]。任翠等[24]研究发现，新型厚朴酚-二甲双胍缀合物低、高剂量组均可抑制小鼠人肝癌细胞HepG2移植瘤生长，且并未产生不良反应，该研究提供了一种将不同功效的两种药物以人工合成的方法，拼接成具有多个核心作用的缀合物分子，以期能达到增强药效或增加药物作用靶点的效果。未来研究可以在揭示二甲双胍抗肿瘤增殖和转移分子机制的基础上，进一步探索二甲双胍与临床抗肿瘤药物联用的效果。