徐圆圆，贾黎明*，赵国春，陈 仲,4，赵田芸，翁学煌

(1 北京林业大学 林学院省部共建森林培育与保护教育部重点实验室，北京 100083；2 北京林业大学国家能源非粮生物质原料研发中心，北京 100083；3 北京林业大学无患子产业国家创新联盟，北京 100083；4 北京林业大学林木分子设计育种高精尖创新中心，北京 100083；5 福建源华林业生物科技有限公司，福建三明 354500；6 福建省源容生物科技有限公司，福建三明 354500)

无患子(SapindusmukorossiGaertn.)属于无患子科(Sapindaceae)无患子属(SapindusLinn.)，是中国传统的洗护用植物和药用植物，其种仁含40%左右的脂肪酸，可用于制备生物柴油和高档润滑油[1]；果皮富含三萜皂苷(4.14%～27.04%)，可用于制作手工皂、洗发水等；无患子皂苷还具有抗菌、抗肿瘤、保护心脑血管系统、杀虫等多种生物活性，在医药、日化、农业等领域应用前景广阔[2-3]。此外，无患子抗逆性强、树型美观、根系发达，夏花、秋叶和果实金黄，是中国南方园林绿化的重要树种[4-5]。目前，中国无患子原料林培育和产业发展迅猛，福建、浙江及湖南等省份已培育近数十万亩原料林，皂用产业及产品得到社会的高度认可[2, 6]。福建建宁县2012年被授予“中国无患子之乡”称号，是中国发展无患子原料林的主要基地[7]。

目前，无患子研究主要集中在种质资源收集和评价[2, 8]、开花结实习性[9-10]、原料林高效培育[11-12]，以及皂苷和油脂的提取、分离、鉴定与应用[1, 13-16]等方面。在果实生长发育方面，刁松峰[17]、邵文豪等[18]对浙江地区无患子果实生长规律进行了研究，并采用多项式对果实横、纵侧径和鲜质量生长动态进行了方程拟合。本团队郑玉琳等[19]对福建地区无患子果实成熟阶段的果实性状、种仁含油率和果皮皂苷含量的变化规律进行了初步研究，但未涉及整个果实生长发育进程。Logistic曲线是“S”型曲线，能很好地描述某些有界增长现象，目前Logistic模型已经在越橘[20]、苹果[21]、龙眼[22]、核桃[23]等果实的生长动态拟合中广泛应用，但采用Logistic方程对无患子果实生长的模拟未见报道。另外，无患子果皮在抵御水分损失和病虫害中起着重要作用，同时也是贮存主要活性物质三萜皂苷的主要场所，张勤等[24]曾对无患子成熟时期干燥果皮的显微结构进行了观察，但关于无患子果实生长过程中果皮显微结构变化的研究仍未见报道。因此，本研究以福建建宁县无患子为材料，对其果实的生长发育规律进行了系统考察，并采用Logistic方程对果实生长发育动态进行曲线拟合，同时观察生长过程中果皮显微结构变化特征，确定无患子果实生长发育的重要时期，可为无患子的高效栽培管理和果实采收策略的制定提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验材料采自福建省三明市建宁县无患子原料林(26°49′N，116°52′E)，树龄10 a，株行距4 m×4 m，管理规范。于2018年6～11月进行果实样品采集，在果园中选取3株树体相近、生长健康、结果量稳定的优树进行采样，单株小区，重复3次。从花授粉后15 d开始测定果实的生长动态，从树冠东西南北四个方向的中上部进行采果，采果量依果实大小而定。每隔15 d采样一次，直至果实成熟。

1.2 测定指标及方法

1.2.1 果实生长指标果实横径(FTD)、果实纵径(FLoD)、果实侧径(FLaD)、种子横径(STD)、种子纵径(SLoD)、种子侧径(SLaD)采用游标卡尺测量(图1)，精确到0.01 cm；百粒果鲜重(FFM)、百粒果皮鲜重(FPM)、百粒种子鲜重(FSM)采用万分之一天平测定，精确到0.1 mg，果皮和种子置于烘箱40℃烘干至恒重后，测定百粒果干重(DFM)、百粒果皮干重(DPM)、百粒种子干重(DSM)，并计算果皮含水率(MCFP)和种子含水率(MCFS)；百粒果体积(FV)、百粒果皮体积(PV)、百粒种子体积(SV)采用排水法测定；果实各生长指标均测定30个果，取平均值，3个技术重复，并计算净增长量。相关计算公式如下：

果皮含水率=(百粒果皮鲜重-百粒果皮干重)/百粒果皮鲜重×100%；

种子含水率=(百粒种子鲜重-百粒种子干重)/百粒种子鲜重×100%。

图1 无患子果实形态Fig.1 Fruit morphology of S. mukorossi

1.2.2 果实内含物含量果皮总三萜皂苷含量(TSCP)采用香草醛-高氯酸比色法进行测定[25]；种子含油率(OCS)采用郑玉琳等的方法进行测定[19]；并计算百粒果皮总皂苷质量(TSMDP)和百粒种子含油量(OMDS)，计算公式如下：

百粒果皮总皂苷质量=果皮总皂苷含量×百粒果皮干重；

百粒种子含油量=种子含油率×百粒果皮干重。

1.2.3 果皮显微结构观察取无患子新鲜果实赤道处果皮组织(所取组织大小依果实大小而定)固定于5% FAA中，3次重复，按常规石蜡切片技术进行切片制作[26]。用Olympus BX43F型光学显微镜(日本奥林巴斯有限公司)观察所制切片并拍照。

1.3 数据分析

采用Origin 2017软件进行生长动态曲线和净生长量曲线的绘制；采用R软件进行相关性分析；采用SPSS 25.0软件进行主成分分析，并采用Logistic方程模型对果实生长指标进行曲线拟合[27]，得到Logistics曲线生长过程中的3个关键拐点t1(始盛期)、t2(高峰期)和t3(盛末期)，t1之前为生长初期，t1～t3、t1～t2、t2～t3分别为速生期、速生期前期、速生期后期，t3之后为生长后期。

2 结果与分析

2.1 无患子果实生长发育进程

无患子果实由果皮和种子组成。果皮又可分为外果皮、中果皮和内果皮。外果皮在各生长时期均具有蜡样光泽，15～105 DAP (花授粉后天数)期间为黄绿色，120 DAP开始转色，150 DAP果皮为橙黄色；中果皮肉质，75～105 DAP期间硬度较大、汁液丰富、有黏性，120～150 DAP期间中果皮变柔韧、似胶质；内果皮半透明、膜质，在种子着生处有白色绒毛(图2)。种子表面光滑，15～90 DAP期间，种皮颜色为绿色；105～150 DAP期间，种皮逐渐骨质，颜色加深，最终变为黑色，种脐线形、附近附白色绒毛(图2)。果实完全成熟时，果皮和种子分离。

图2 无患子果实在不同生长发育时期的变化Fig.2 Fruit changes of S. mukorossi at different growth and developmental stages

2.2 无患子果实生长过程中直径、质量和体积生长变化动态

无患子果实和种子的横、纵、侧径以及鲜重、干重和体积的生长总体上均呈“慢-快-慢”变化趋势，为典型的单“S”型生长曲线(图3)。其中，无患子果皮的鲜重、干重和体积在整个果实生长阶段均比种子大(图3，A)。果实和种子的横、纵、侧径在生长过程中变化趋势相似，均出现一个生长高峰 (图3，B)；在105 DAP时，果实横径(24.61 mm)和侧径(21.62 mm)达到最大值，果实纵径和种子横、纵、侧径则在90 DAP达到最大值。百粒果、果皮、种子鲜重和百粒果、种子体积的净生长量均在45～60 DAP阶段最大(图3，B)；百粒果、果皮、种子鲜重，百粒果、果皮、种子干重，以及百粒果、果皮、种子体积分别在105、120、90、135、135、135、105、135和90 DAP达到最高。

A.累积生长量；B.净生长量图3 无患子果实和种子直径、质量和体积生长变化A. Cumulative growth; B. Net growthFig.3 The diameter, mass and volume growth of fruit and seed of S. mukorossi

2.3 无患子果实生长过程中含水率及内含物的变化特征

由表1可知，无患子果皮含水率、种子含水率、果皮总皂苷含量、百粒果皮总皂苷质量、种子含油率、百粒种子含油量在不同发育时期间差异显著。其中，无患子果皮和种子含水率均随着果实的生长先增加后降低，分别在45 DAP和30 DAP时达到最高，分别为71.00%和81.91%；均在150 DAP时降至最低，分别为22.02%和14.90%。果皮总三萜皂苷含量在整个果实生长周期内呈先增加后降低趋势，先从15 DAP的12.30%增加至90 DAP的19.30%，此后下降，在120～150 DAP期间总皂苷含量相对稳定(16.03%～17.03%)；百粒果皮总皂苷质量随着果实生长呈逐渐增加趋势，在135 DAP达到最高；种子含油率和百粒种子含油量均随着种子的生长逐渐增加，均在150 DAP时达到最大，在60～120 DAP阶段种子油脂积累速度最快。

表1 无患子果实含水率和内含物的变化

2.4 无患子果实生长指标Logistic方程拟合和综合分析

2.4.1 生长方程模型拟合采用Logistic方程对无患子果实生长指标的生长模型进行曲线拟合，r在0.884～0.998之间，显著性均达到显著或极显著水平，且不同指标各生长阶段的起始时间及持续时间存在差异(表2)。其中，果实和种子横、纵、侧径进入速生期和结束速生期的时间均较其他生长指标早，且达到生长高峰期(约30 DAP)的时间相近；百粒果、果皮、种子鲜重和体积进入速生期的时间相近，大概在35 DAP，百粒果、果皮、种子干重进入速生期的时间在50 DAP左右；百粒果皮鲜重、干重和体积到达生长高峰期的时间和速生期持续的时间均大于种子；百粒果皮总皂苷质量和百粒种子含油质量进入迅速积累期的时间分别为46和78 DAP，到达积累高峰期的时间分别为69和90 DAP，迅速积累期分别为47和26 d。

表2 无患子果实生长指标的Logistic模型

2.4.2 生长指标综合分析无患子果实的21个生长指标间相关性分析结果表明，果实和种子的直径、质量、体积等指标间极显著正相关；果皮总皂苷含量、百粒果皮总皂苷质量、种子含油率、百粒种子含油量与果实直径、质量、体积等指标间也存在极显著正相关性关系 (表3)。

表3 无患子果实各生长指标间的相关系数

同时，这些果实生长指标的主成分分析结果(表4)显示，前2个主成分的累计贡献率达93.320%。其中，第一主成分PC1包含了原始信息量的55.130%，其大小主要由种子横、纵、侧径和百粒种子鲜重、体积决定，可以反映种子大小和鲜重状况；第二主成分PC2包含了原始信息量的38.190%，其大小主要由种子含油率和百粒种子含油量决定，可以反映种子内含物的积累状况。依据相关性分析结果可知，无患子果实百粒种子鲜重分别与种子横、纵、侧径以及百粒种子体积之间呈极显著正相关，种子含油率和百粒种子含油量之间极显著正相关，而百粒种子鲜重和种子含油率的测定方法相对简便，所以可以用百粒种子鲜重和种子含油率来反映无患子果实的生长性状。

表4 主成分分析旋转后成分载荷矩阵

2.5 无患子果实生长过程中果皮显微结构变化特征

不同生长时期无患子果皮结构大体相似，但细胞形态及大小存在差异(图4, A)。无患子表皮细胞外被角质层，呈透明带状，并嵌入表皮细胞间隙，角质层随果皮的生长不断增厚；15～45 DAP期间，表皮细胞多为单层、类方形、排列整齐、间隙小；随着果实生长，表皮细胞变为1～ 4层，形状不规则，细胞变松散(图4, B)。中果皮近表皮一侧为6～12层厚角细胞，细胞呈卵圆形或长条形，相互重叠排列成板条状，随着果实生长厚角细胞逐渐变大，在果实成熟时变细长(图4, B)；中果皮内侧是薄壁细胞和大量溶生式分泌腔，薄壁细胞在15～90 DAP期间呈近球形，鹅卵石状排列，随着果实生长体积逐渐增大、间隙变明显，120 DAP时开始变形，果皮中部薄壁细胞扭曲，近内果皮一侧的细胞变细长，随着果实成熟薄壁细胞变形加剧(图4, A)；分泌腔随着果实生长不断增多、变大；外韧型维管束稀疏分布在薄壁组织中，在果实生长过程中维管束主要有4种类型(图4，C)，生长初期的维管束结构分化不明显(图4，C,①)，随着果皮的生长，维管束逐渐发育成熟，并在韧皮部外侧分化出木化的纤维束(图4，C，③～④)；此外，薄壁细胞中还含有众多草酸钙结晶和石细胞，草酸钙结晶多为棱角尖锐的簇晶(图4，D，①)，少数为方晶(图4，D，②)，石细胞类圆形或不规则，细胞壁厚(图4，D，③)。内果皮由3～5层极扁平的木化细胞紧密层叠而成，随着果实生长内果皮结构上无明显变化(图4，D，④)。

A.不同生长时期果皮横切面整体图片，×4，图中数字1-7分别表示外果皮、厚角组织、分泌腔、维管束、草酸钙结晶、薄壁细胞和内果皮；B.外果皮横切面图片，×40；C.中果皮中不同生长时期的维管束，①～④分别为15 DAP (×40)、45 DAP (×40)、75 DAP (×20)、90 DAP (×20)中存在的维管束，PC、P、X、FB、SC分别表示薄壁细胞、韧皮部、木质部、纤维束、分泌腔；D.中果皮中的簇晶和内果皮，①～④分别为簇晶×40 (105 DAP)、方晶×40 (30 DAP)、石细胞×40 (105 DAP)和内果皮×40 (150 DAP)，CC、SCT、PC、SCL、Enp分别表示簇晶、方晶、薄壁细胞、石细胞和内果皮图4 无患子果皮不同生长时期的显微结构A. Cross section of pericarp at different growth stages, ×4, numbers 1 - 7 indicate the exocarp, collenchyma, secretory cavity, vascular bundle, calcium oxalate crystal, parenchyma cell, and endocarp, respectively; B. Cross section of exocarp ×40; C. Vascular bundles in mesocarp at different growth stages: Fig. ① - ④ are vascular bundle at 15 DAP (×40), 45 DAP (×40), 75 DAP (×20), and 90 DAP (×20), respectively; PC, P, X, FB and SC represent parenchyma cell, phloem, xylem, fiber bundle and secretory cavity, respectively; D. Cluster crystal in mesocarp and endocarp: Fig. ① - ④ are cluster crystal at 105 DAP (×40), square crystal at 30 DAP (×40), sclereid 105 DAP (×40), and endocarp at 150 DAP (×40), respectively. CC, SCT, PC, SCL, and Enp represent cluster crystal, square crystal, parenchyma cell, sclereid, and endocarp, respectivelyFig.4 Microstructure of pericarp in S. mukorossi at different growth stages

2.6 无患子果实生长时期划分及其外部形态和果皮显微结构特征

根据果实生长指标变化规律和Logistic方程模型的拟合结果，可将无患子果实生长发育进程划分为生长初期(0～30 DAP)、速生期(30～90 DAP)、生长后期(90～120 DAP)和果实成熟期(120～150 DAP) 4个阶段，其具体外部形态及果皮显微结构特征如表5所示。

表5 无患子果实生长过程中外部形态及果皮显微结构特征

3 讨 论

无患子果实各生长指标总体上呈现为“慢-快-慢”的单“S”型变化曲线，采用Logistic方程对其进行拟合，拟合系数在0.884～0.998之间，显著性均达到显著或极显著水平，说明可以用Logistic方程对无患子生长节律进行拟合分析。根据Logistic方程模型得出了各生长指标生长过程中的关键时间点，无患子果实不同生长指标进入速生期/迅速积累时期、达到生长/积累高峰期和结束速生期/迅速积累时期的时间存在差异。果实和种子横、纵、侧径到达生长高峰期的时间在30 DAP左右，说明果实和种子的直径生长具有一定的同步性；百粒果实干重增长最快的时期晚于直径、鲜重和体积，这与徐臣善等[21]、刘丽琴等[28]的研究结论相似。百粒果皮总皂苷质量进入迅速积累时期、积累高峰期和结束迅速积累时期的时间分别为46、69和93 DAP，说明这些时间点是果皮中皂苷积累的3个关键点；百粒种子含油质量进入迅速积累时期(78 DAP)和到达积累高峰期(91 DAP)的时间均最晚，可见无患子种子中油脂的积累主要在生长中后期完成。本研究中，无患子果实大部分生长指标间存在极显著正相关性关系，说明无患子果实生长发育与其内含物的积累具有很好的一致性；各生长指标间相互关联，并表现出有顺序、有节奏的变化趋势[29]。对本研究中的21个指标进行主成分分析，可将其简化为2个主成分，代表了原始数据93.320%的信息，最终确定百粒种子鲜重和种子含油率为无患子果实的关键性生长指标。

无患子果皮中富含生物活性成分三萜皂苷，是果实的重要组成部分。外果皮最外层为角质层，对果实起着保护作用，其厚度还能影响果实的贮藏特性[30-31]；无患子角质层随着果皮的生长不断增厚，可见无患子成熟果实耐贮性较好[32-33]。无患子内果皮中的薄壁细胞在生长中前期形状规则、排列紧密，随着果实生长，薄壁细胞体积和间隙变大，使果实直径、质量、体积等不断增加；果实生长后期，中部薄壁细胞变形，果皮变柔韧，这是由于果胶在果胶酶的作用下分解，细胞游离、失水变形；果皮中的淀粉、有机酸等被水解变成可溶性糖，高含量的蔗糖等可溶性糖的存在使得成熟的无患子果皮黏性较大[34]。无患子果皮中还含有许多大型溶生式分泌腔，是其三萜皂苷类物质的贮藏场所；这些分泌腔在果实生长前期体积较小，但随着果实的生长，细胞分泌物不断增多，细胞破裂溶解形成腔穴或腔囊，在人参、三七、刺五加等富含三萜皂苷的植物中也具有类似的分泌腔[35]。无患子果皮薄壁细胞中还散布着许多草酸钙结晶、维管束和石细胞等，这些结构可能起着防御、加强果皮机械支持能力、增强果皮抗胁迫能力等作用[36-37]，果皮中的维管束还与水分运输相关[38]。

无患子果实生长初期(0～30 DAP)，从授粉受精到果实开始膨大，细胞分裂导致细胞数目增加，果实和种子横、纵、侧径变化较快；此时可适当疏花疏果，并及时采用施肥、激素调控等措施进行稳果[4]。果实速生期(30～90 DAP)，主要表现为果实的膨大，该时期是果实鲜重、干重和体积增加以及品质形成关键阶段；应注意加强树体的肥水管理，以保证果实正常膨大[39]。果实生长后期(90～120 DAP)，果实体积、鲜重、干重增长速率变缓，果皮皂苷、可溶性糖和种子油脂含量增加迅速，主要表现为果实内含物的积累和糖分的转化[18]；该时期应保证树体有较大的光合面积，以提高果实营养物质积累与转化，促进果实成熟；同时，这一时期也是无患子外观品质形成的关键时期，在做好追肥和病虫害防治的同时，还应保持果园的通风等，以提高无患子果实的产量和品质。果实成熟阶段(120～150 DAP)，果皮转色、失水、皱缩，种子变黑、失水、变小；到果实完全成熟时(150 DAP)，果皮金黄、皱缩，种子与果皮脱离。郑玉琳等[19]指出针对果皮皂苷和种仁油脂的用途，果实变为黄色、果皮开始皱缩后的20 d内是无患子的最佳采果期，与本研究中的135～150 DAP这一阶段相对应。但根据无患子产地的生产经验，结合本研究结果，可以对无患子果实采收期进一步划分：120～150 DAP均适合无患子采收果实，其中135 DAP为果实采收后进行果皮皂用的最佳时期，该时期百粒果皮总皂苷质量最大，果皮含水率相对较低；150 DAP为果实采收后进行种子油用或果实综合利用的最佳时期，此时果皮和种子含水率均降至最低，百粒果皮总皂苷质量相对较大，百粒种子含油量最高。此外，还应该考虑果园当地的天气状况，无患子在果实成熟期如遇大风或持续降雨天气，容易导致大量落果，而且长期处在空气湿度大的环境中，可能会使果实产生锈斑、裂果或发霉，影响果实外观品质，采收后也不利于贮藏，这种情况下可以考虑在最佳采果期前采收无患子果实。