朱天宝，涂 杰，盛春泉，徐德锋，刘 娜（.常州大学药学院，江苏 常州 364；.海军军医大学药学系，上海 00433）

近年来，随着肿瘤、器官移植和获得性免疫缺陷综合征(AIDS)等导致的免疫功能低下人群的增加，侵袭性真菌感染（IFIs）的发病率和病死率逐年上升[1-2]。念珠菌、隐球菌和曲霉菌是IFIs 最主要的致病菌，并且造成的病死率超过90%[3]。在念珠菌属中，白念珠菌（Candida.albicans）是院内血液感染最常见的致病菌原体，其在重症监护病房（ICU）患者中致病率超过17%，病死率高达40%[4-5]。临床上治疗IFIs 的抗真菌药物主要包括：多烯类（两性霉素B）、核酸类（5-氟胞嘧啶）、唑类（氟康唑）和棘白菌素类（卡泊芬净）药物（图1）[6-7]。然而，由于临床上出现抗真菌药物严重的耐药性和毒副作用，IFIs 的治疗效果相当有限。因此，迫切需要研发全新机制的抗真菌药物。

图1 临床上治疗IFIs 的抗真菌药物

组蛋白乙酰化修饰（包括组蛋白乙酰化和去乙酰化）是表观遗传学研究的重要组成部分。组蛋白去乙酰化酶（HDACs）将组蛋白和其他蛋白上的赖氨酸末端乙酰基去除，对染色体重塑和基因的表达起着重要作用[8-9]。目前HDAC 抑制剂主要集中于抗肿瘤研究方向，且已有多个上市药物应用于肿瘤的治疗。据研究报道，真菌中的HDACs，如烟曲霉[10]、白念珠菌[11-12]、酿酒酵母[13]和新生隐球菌的HDACs[14-15]参与了毒力相关的过程和形态变化。因此，抑制真菌HDACs 可能是治疗IFIs 的有效策略。

联合药物治疗是提高临床一线药物疗效并克服真菌耐药性的有效策略之一。真菌的耐药性涉及转录调节，其中染色体重塑和组蛋白修饰起主要作用。HDACs 调节的组蛋白修饰在应激信号通路中起着至关重要的作用，这可能与真菌对各种环境（包括药物）的应激反应有关[16]。此外，已有研究报道，HDAC 抑制剂与唑类药物联用具有协同增效作用[17-18]。例如，HDAC 抑制剂MGCD290 与氟康唑联用具有协同抗多种临床真菌分离株的作用[19]。

基于此，本研究首先对8 个市售的HDAC 抑制剂（图2）进行体外协同抗真菌活性测试，筛选结果显示化合物Rocilinostat 与氟康唑联用具有优秀的体外协同抗耐药白念珠菌活性。后续考察其与不同唑类药物联用时对不同念珠菌属的体外协同抗真菌活性，以及对正常细胞的毒性作用，以期为抗真菌药物的研发提供依据。

图2 HDAC 抑制剂的化学结构

1 材料和方法

1.1 实验试剂与菌株

临床分离的6 株唑类耐药白念珠菌（编号：9893，10061，10060，9173，4108 和0304103），2 株唑类耐药热带念珠菌（编号：5008，10086），1 株光滑念珠菌（编号：9073）和1 株耳道念珠菌（编号：0029）由海军军医大学附属长征医院提供。菌株活化首先从−80 ℃中挑取菌株冻存液至YEPD 液体培养基活化24 h,然后取10 μl 菌悬液至1 ml YEPD中，并在30 ℃、200 r/min 下培养16 h 后待用。HUVEC细胞来源于中国科学院上海细胞库，并在新鲜配置的DMEM 完全培养基中培养。

YEPD 液体培养基：取10 g 酵母浸膏、20 g 葡萄糖、20 g 蛋白胨溶解于1 000 ml 三蒸水中，经高压蒸汽灭菌（121 ℃,15 min）后，保存于4 ℃条件下备用。RPMI 1 640 培养基：取10 g RPMI 1 640（Gibco）粉末、34.5 g 吗啡啉丙磺酸、2 g NaHCO3、2.7 g NaOH 溶解于1 000 ml 三蒸水中，经0.22 μm的微孔滤膜过滤与灭菌后，置于4 ℃条件下保存和备用。DMEM 完全培养基：按照89% DMEM 基础培养基+10%胎牛血清+1%的双抗比例混匀制得，混匀后置于4 ℃条件下保存和备用。PBS 缓冲液：10 × PBS 100 ml 溶解于900 ml 三蒸水中，经高压蒸汽灭菌（121 ℃,15 min）后，置于4 ℃条件下保存和备用。

1.2 仪器

THZ-92A 气浴恒温振荡器（上海博迅医疗生物仪器股份有限公司）、MJ-150-I 霉菌培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）、LW100T 生物显微镜（北京测维光电技术有限公司）、HDC-15K 高速离心机（上海泰坦科技股份有限公司）、C170 二氧化碳培养箱（BINDER GmbH）、infinite M200 多功能酶标仪（Tecan Austria GmbH）、高压蒸汽灭菌锅、无菌洁净工作台。

1.3 棋盘式微量液基稀释法

本实验参照美国临床和实验室标准协会（CLSI）公布的M27-A3 方案中微量液基稀释法进行。首先，收集活化好的真菌细胞，PBS 洗3 次后用RPMI 1 640 培养基制成浓度为1×103CFU/ml的菌悬液。按照每孔100 μl 接种菌悬液至无菌96 孔板中，1～9 列加入倍半稀释的HDAC 抑制剂，A～F 行加入倍半稀释的氟康唑，其中G 行只加氟康唑，第10 列只加化合物，第11 列为不加药的阴性对照组，后将96 孔板置于35 °C 条件下孵育48 h。测定每孔在630 nm 处的吸光度A，依据公式：抑制率（%）=（A阳性对照孔−A化合物孔）/（A阳性对照孔−A阴性对照孔）× 100%，计算各孔对应的抑制率。如果某一孔和其左边孔对应的抑制率均大于80%，则该孔对应的化合物和FLC 浓度分别作为FIC化合物和FIC氟康唑，利用协同指数公式：FICI=（FIC化合物./MIC80化合物）+（FIC氟康唑/MIC80氟康唑），计算各化合物对应的FICI。

1.4 时间-生长曲线实验

收集活化好的白念珠菌0304103 稀释在RPMI 1640 培养液中，保持菌浓度为1×105CFU/ml。取5 ml 稀释的菌悬液和不同浓度的待测药物加入50 ml 的离心管中,DMSO 组作为空白对照组和32 μg/ml FLC 作为阳性对照。随后将50 ml 的离心管置于30 °C 条件下振荡培养（200 r/min），在多个时间点吸取不同药物组的真菌混悬液（100 μl）于96 孔板上，测量A630值并使用GraphPad Prism 7 作图。

1.5 真菌细胞总HDAC 酶活性测试实验

收集指数生长期的白念珠菌0304103 细胞（湿重为100 mg），然后用3 mg snailase、12 μl 2-巯基乙醇和3 ml snailase 反应缓冲液等新鲜配置的真菌裂解液来处理它们，以制备真菌原生质体。真菌原生质体分散在PBS（20 ml）中以获得混悬液，然后往96 孔板每孔中加入100 μl 的混悬液和不同浓度的化合物Rocilinostat，并在35 °C 下培育12 h。接着往每个孔中加入30 μmol/L 的HDAC 底物，于37°C 下孵育6 h。随后添加100 μl HDAC 酶促终止溶液并在37°C 下孵育2 h。最后，在每个孔中取出100 μl 培养物添加到黑板中，用Ex=360 nm，Em=460 nm 来监测荧光强度并记录下来用于计算HDAC 酶的抑制率。

2 结果

2.1 化合物Rocilinostat 与氟康唑联用具有协同抗真菌活性

表1 列出了HDAC 抑制剂单独使用或与氟康唑联合使用的体外抗真菌活性筛选结果。MIC80为抑制80%真菌细胞生长的最低药物浓度。实验结果表明，8 个HDAC 抑制剂单独使用对耐药白念珠菌均无直接的抗真菌活性（MIC80>64 μg/ml）；而化合物Rocilinostat（FICI=0.039）和伏立诺他（FICI=0.125）与FLC 联用时均表现出良好的协同抗真菌活性。其中，化合物Rocilinostat 的协同活性最佳，值得进一步研究。

表1 单用HDAC 抑制剂或者与氟康唑联用对白念珠菌0304103 的体外抗真菌活性(μg/ml)

2.2 Rocilinostat 与氟康唑或伏立康唑联用对多种白念珠菌的抗真菌活性

为进一步考察Rocilinostat 是否具广谱的抗真菌作用，挑选9 株临床分离的念珠菌属菌株进行协同抗真菌活性测试。如表2 所示，Rocilinostat 与FLC 联合使用时，对两株耐FLC 的白念珠菌（C.albicans9 173，FICI=0.094;C.albicans4 108,FICI=0.5）和对FLC 敏感的光滑念珠菌（C.glabrata9 073）表现出协同增效作用，而对热带念珠菌（C.tropicis）和耳道念珠菌（C.auris）没有协同抗真菌活性。当Rocilinostat 与伏立康唑（VRC）联用时，对耐VRC的白念珠菌（C.albicans10 060,FICI=0.033）表现出优异的协同抗真菌活性 (表3)。

表2 Rocilinostat 与氟康唑单用或联用对多种念珠菌菌株的体外抗真菌活性[MIC80 (μg/ml)]

表3 Rocilinostat 与伏立康唑单用或联用对白念珠菌菌株的体外抗真菌活性[MIC80 (μg/ml)]

2.3 Rocilinostat 与氟康唑联用有效抑制真菌的生长

为进一步考察化合物Rocilinostat 的协同抗真菌活性，我们又开展了时间-生长曲线实验。从图3结果可以看出，高浓度的氟康唑或Rocilinostat 单独使用对真菌生长无抑制作用，而Rocilinostat 与不同浓度的氟康唑联用能够有效抑制真菌的生长，且呈浓度依赖趋势 (图3 中抑制剂为Rocilinostat)。

图3 化合物Rocilinostat 和氟康唑联用对白念珠菌的生长抑制作用

2.4 Rocilinostat 对真菌细胞的选择性作用

采用HUVEC（人脐静脉内皮细胞）对化合物Rocilinostat 进行细胞毒性的评价。结果如表4 显示，化合物Rocilinostat 对正常细胞表现出低毒性，IC50值为52.17 μmol/L (22.60 μg/ml)，相当于其发挥协同抗耐药真菌（C.albicans0304103）活性MIC80值的44 倍，表明Rocilinostat 对真菌细胞具有较强的选择性作用。此外，我们还测试了化合物Rocilinostat对真菌总HDAC 酶的抑制活性，结果表明，Rocilinostat对真菌HDAC 酶抑制活性（IC50=0.41 μmol/L）优于泛HDAC 抑制剂伏立诺他（IC50=1.03 μmol/L）。

表4 Rocilinostat 对正常细胞的毒性和真菌总HDAC 酶活性IC50 (μmol/L)

3 讨论

本研究从市售的8 个HDAC 抑制剂中筛选出协同活性最佳的化合物Rocilinostat。进一步研究发现Rocilinostat 与氟康唑联用对白念珠菌和光滑念珠菌具有协同增效作用。此外，化合物Rocilinostat与伏立康唑联用对临床分离的耐药白念珠菌株同样具有优秀的抗真菌活性。更值得关注的是，化合物Rocilinostat 对正常细胞表现出低毒性，其对真菌细胞具有很好的选择性。因此，HDAC 抑制剂Rocilinostat 可以作为一种低毒、有效的唑类抗真菌药物增效剂，为抗真菌药物的发展提供了新的研究基础。