戴建英，尤 巍，田 甜，洪战英（1.福建中医药大学药学院,福建 福州 3501；.海军军医大学药学系,上海 00433）

中药知母（Anemarrhenae rhizoma）为百合科植物知母(Anemarrhena asphodeloidesBge.)的干燥根茎，始载于《神农本草经》，具有清热泻火，肺热燥咳，滋阴润燥以及肠燥便秘等作用[1]。知母根茎中含有甾体皂苷类、黄酮类、双苯吡酮类、木质素类、多糖类和生物碱类等多种成分，甾体皂苷类是其首要药理活性成分。其中新芒果苷、芒果苷等黄酮苷类单体成分具有降低血糖的作用，知母皂苷BⅡ以及知母皂苷AⅢ等甾体皂苷类单体成分具有改善学习记忆、抗老年痴呆的作用[2]。

《中国药典》（2020 年版）将芒果苷和知母皂苷BⅡ作为知母的质量评价指标[3]，目前知母中芒果苷和新芒果苷的含量测定方法多采用高效液相-紫外检测法，而知母中另外一类重要的活性成分甾体皂苷类，由于不存在共轭结构、缺少紫外吸收，需通过衍生化技术将其转化成有紫外特征吸收的物质；但这种操作复杂、耗时，且准确度受衍生物稳定性的影响较大[4-5]，因此紫外检测器并不适用于甾体皂苷类物质的检测。相比于紫外检测器，蒸发光散射检测器（ELSD）不要求化合物带有发色团或荧光基团，能够测定没有紫外吸收或为紫外末端弱吸收的样品；而且可以在多溶剂梯度的情况下获得稳定的基线和较高的分辨率。目前，已有应用HPLCELSD 法对知母药材中单种成分或多成分含量测定的报道[6-7]，但是所建立的方法往往分析时间较长，消耗试剂较多。

本文建立了一种快速、简便、准确的HPLCELSD 方法，可同时测定知母中3 个黄酮类成分（新芒果苷、芒果苷、宝藿苷Ⅰ）和2 个甾体皂苷类成分（知母皂苷BⅡ、知母皂苷AⅢ）的含量，可为知母药材质量控制提供参考依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

高效液相色谱仪（1260 InfinityⅡ Prime LC,美国安捷伦公司）；蒸发光散射检测器（G4260B，美国安捷伦公司）；分析天平（XS205，梅特勒-托利多国际公司）、涡旋混合器（SCILOGEX MX-S，美国Scilogex 公司）、超声波清洗器（2300TH 型，上海安谱实验科技股份有限公司）。

1.2 试药

新芒果苷对照品（批号：3671）、芒果苷对照品（批号：5586）、知母皂苷BⅡ对照品（批号：1369）、宝藿苷Ⅰ对照品（批号：1869）、知母皂苷AⅢ对照品（批号：3892）购自上海诗丹德标准技术服务有限公司；知母药材由上海市食品药品检验所中药室赠予；色谱纯乙腈（北京迪科马科技有限公司）；色谱纯异丙醇（上海安谱实验科技股份有限公司）；分析纯乙醇和乙酸（国药集团化学试剂有限公司）。

2 方法与结果

2.1 溶液的配制

2.1.1 对照品溶液

精密称取芒果苷、新芒果苷、知母皂苷BⅡ、宝藿苷Ⅰ和知母皂苷AⅢ 对照品适量，置于5 ml容量瓶中，加50%乙醇溶液适量，超声溶解后，加入50%乙醇稀释并定容得到混合溶液，精密量取1 ml该混合溶液置于5 ml 容量瓶中，加50%乙醇溶液定容，最终得含芒果苷464 μg/ml，新芒果苷482 μg/ml，知母皂苷BⅡ 1 084 μg/ml，宝藿苷Ⅰ 106 μg/ml，知母皂苷AⅢ 200 μg/ml 的混合对照品储备液，摇匀备用。

2.1.2 供试品溶液

取知母药材适量，干燥后粉碎，过3 号筛得知母药材粉末。取药材粉末0.5 g，精密称定，置于50 ml具塞锥形瓶中，精密加入50%乙醇50 ml，称重，超声（功率300 W，60 Hz）处理30 min。超声结束后放置至室温后再次称定质量，使用50%乙醇补足所减失的质量，摇匀后滤过。取续滤液过0.22 μm微孔滤膜，作为供试品溶液。

2.2 色谱条件

色谱柱为Agilent poroshell 120 EC-C18柱（2.1×100 mm，2.7 μm）；流动相为乙腈(A)-0.2%醋酸水(B)；梯度洗脱程序设定为0～3 min，4%～10%A；3～5 min，10%A；5～7 min，20%A；7～11 min，20%～25%A；11～14 min，25%～90%A；14～18 min，90%A；18～19 min，90%～4%A；19～20 min，90%～4%A。柱温为30 ℃；流速为0.7 ml/min。蒸发光散射器的参数设定雾化气温度为40 ℃；漂移管温度为90 ℃；氮气体积流量为2.0 ml/min。供试品进样量为20 μl。混合对照品和供试品色谱图见图1，新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BⅡ、宝藿苷Ⅰ、知母皂苷AⅢ 的保留时间分别为4.05、5.49、11.63、13.85、14.38 min，各成分之间分离度均>1.5。

图1 知母混合对照品(A)和样品(B)的HPLC-ELSD 色谱图

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系

精密量取1.6 ml 混合对照品储备液和0.4 ml 50%乙醇溶液，涡旋30 s 混匀，后使用50%乙醇依次对半稀释。按上述色谱条件进行测定，以峰面积（A）的对数值与进样浓度（C）的对数值进行线性回归，考察结果见表1，表明知母中各成分在相应的浓度范围内均呈现良好的线性关系。

表1 知母中5 种成分线性回归方程和线性范围

2.3.2 精密度试验

精密吸取混合对照品20 μl，按上述色谱条件连续进样6 次，计算5 种成分峰面积的RSD 值，结果显示，新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BⅡ、宝藿苷Ⅰ、知母皂苷AⅢ的RSD 分别为1.3%、1.0%、0.9%、1.5%、1.0%、1.4%，表明仪器精密度良好。

2.3.3 重复性试验

称取知母药材粉末0.5 g，精密称定，平行称取6 份，按上述操作制备供试品溶液，进样测定，计算新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BⅡ、宝藿苷Ⅰ、知母皂苷AⅢ的含量分别为1.62%、0.82%、7.36%、0.07%、0.34%，RSD 分别为1.8%、1.8%、1.4%、2.2%、2.4%，显示方法重复性良好。

2.3.4 稳定性试验

称取知母药材粉末0.5 g，按上述操作制备供试品溶液，分别于制备后0、2、4、6、8、12 h 进样测定，结果显示新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BⅡ、宝藿苷Ⅰ、知母皂苷AⅢ的峰面积RSD 分别为：2.3%、1.3%、0.9%、3.1%、1.8%，说明样品在12 h内稳定。

2.3.5 加样回收率试验

称取知母药材粉末0.25 g，精密称定，平行称取6 份，分别加入与知母药材粉末各成分含量相近的混合对照品溶液，按上述操作制备供试品溶液，进样测定，计算加样回收率。结果见表2，知母中5 种成分的平均回收率为101.8%～105.0%，表明该方法准确度良好。

表2 知母中5 种成分加样回收率试验结果（n=6）

2.3.6 样品含量测定

称取知母药材粉末0.5 g，精密称定，按上述操作进样测定，计算各成分含量，最终计算得新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BⅡ、宝藿苷Ⅰ、知母皂苷AⅢ的平均含量分别为1.62%、0.82%、7.36%、0.07%、0.34%。

3 讨论

3.1 流动相系统选择

本研究首先采用乙腈-水作为流动相，结果发现新芒果苷、芒果苷峰形不佳，色谱峰出现分叉现象。考虑到该两种物质呈弱酸性，故采用乙腈-0.2%醋酸水溶液作为流动相以抑制其解离，结果显示其分叉现象消失，各峰之间的分离度良好，且基线平稳，因此最终采用乙腈-0.2%醋酸水溶液作为最终流动相系统。结果如图2 所示。

图2 不同流动相系统对新芒果苷（1）和芒果苷（2）的影响

3.2 氮气流速考察

流动相流出色谱柱后在载气压力的作用下与雾化气体（氮气）在雾化室内混合形成细小的液滴（气溶胶），气体流量越低，形成的液滴越大，散射光越多，分析灵敏度增加，反之越小。但是较低的气体流量会造成溶剂难以蒸发，因此本研究考察了氮气流速分别为1.5、2.0、2.5 L/min 时各待测物质的响应值，结果显示，当氮气流速为2.0 L/min 时待测物质响应值最大，信号噪音比率最大，适合分析。

3.3 漂移管温度考察

漂移管温度的设置主要取决于流动相的构成、样品的挥发性以及流动相的流速。一般来讲，对于有机溶剂含量比例高、流速低的流动相，其要求的漂移管温度也低。本研究使用含新芒果苷386 μg/ml、芒果苷371 μg/ml、知母皂苷BⅡ 867.2 μg/ml、宝藿苷Ⅰ 84.8 μg/ml、知母皂苷AⅢ 160 μg/ml 的混合对照品溶液，考察了漂移管温度分别为80、90、100 ℃时各待测物质的响应值，结果表明当漂移管温度为90 ℃时各物质峰面积响应值均较大，信号噪音比率最大，适合分析，因此最终漂移管温度采用90 ℃。结果如图3 所示。

图3 漂移管温度对待测物质响应值的影响

本研究建立了一种同时测定知母药材中包括芒果苷、知母皂苷BⅡ在内的5 种活性成分含量的HPLC-ELSD 方法。该法快速、简便、准确度高，可为知母的质量评价和质量标准的提升提供科学依据，为知母有效成分的体内动态变化研究提供测定方法。