李 想，吕 琴，吴秋月，沈 颖△

(1.昆明理工大学医学院，昆明 650093；2.昆明理工大学附属医院，昆明 650032；3.云南省第一人民医院，昆明 650032；4.云南中医药大学，昆明 650500)

国际糖尿病联盟发布的糖尿病地图集显示，2017年全球约有4.51亿糖尿病患者，并估计2045年这一数字将达到6.93亿人[1]。目前，全球糖尿病发病人数的增加主要在发展中国家，尤其是印度和中国，其患病率分别排在第1、2位。根据世界卫生组织预测，2025年我国预计将有1.4亿2型糖尿病患者[2]。随着人们生活水平的提高及人们饮食习惯的改变，肥胖人群逐年上升，肥胖症与2型糖尿病并存的肥胖相关的2型糖尿病的患病率也逐年上升，并且肥胖相关的2型糖尿病的致病机制较常规2型糖尿病更加复杂[3]。同时糖尿病并发症随糖尿病发生率上升也随之升高，其中糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病最常见的微血管并发症，也是最常见的慢性肾脏病，并且是导致终末期肾脏病的主要原因之一[4]。糖尿病及其并发症——DN发病率逐年升高，已成为世界关注的全球公共卫生问题。一项对全国慢性肾脏病住院患者的调查结果显示，DN住院人数逐年升高，现已成为慢性肾脏病住院患者人数最多的病种[5]。近年来，DN的发病率呈上升趋势，归因于DN的社会医疗负担越来越重[6]。目前，对DN的治疗主要以控制体重、血糖、血压，以及调脂等对症处理[7]，然而现有的治疗手段并不能完全阻断DN进展，寻找新的发病机制及治疗靶点至关重要。

构建良好的DN模型是研究DN的基础。目前，对DN的模型构建方法有多种，化学诱导法为常用的动物模型构建方法，以化学药物——四氢嘧啶或链脲佐菌素(streptozocin，STZ)破坏动物胰岛细胞，模拟糖尿病胰岛素缺乏及血糖升高的病理表现，以构建糖尿病及糖尿病并发症的动物模型[8]。影响模型成功的因素很多，其中小鼠品系及小鼠年龄的选择对造模的影响十分重要[9-10]。目前，化学诱导法常用的动物模型为SD大鼠和Wistar大鼠[10]，其造模成本较高，而实验室最常用的C57小鼠被认为具有相对的天然DN抵抗[11]。本研究探索具有相对DN抵抗的C57小鼠能否通过常规高脂高糖饮食联合化学诱导法构建比较符合肥胖相关的2型糖尿病并发症DN发病机制的小鼠模型，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物

选取无特定病原体级雄性C57Bl/6J小鼠，3周龄(12～15 g)、5周龄(18～22 g)各12只(昆明理工大学动物中心)。

1.1.2试剂与仪器

STZ购自美国Sigma公司，高脂高糖饲料(猪油28%、蔗糖10%、全脂奶粉10%，其余均为维持饲料成分)购自江苏协同生物公司，Masson三色染色试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司，糖原PAS染色试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；柠檬酸缓冲液(国产)、无水葡萄糖(国产)、尿蛋白试纸(优利特)、血糖试纸(罗氏)等。包括光学双目显微镜(江南)、石蜡切片机(Leica RM2235)、血糖仪(罗氏)、小鼠灌胃器(国产)等。

1.2 方法

1.2.1动物模型的建立

将3周龄、5周龄小鼠分为实验组和对照组，实验组给予高脂高糖饮食，对照组给予普通饮食。实验前对所有小鼠进行空腹血糖测量，入组小鼠要求空腹血糖小于7 mmol/L，排除先天存在血糖异常小鼠。实验组以高脂高糖饲料饲养8周，定期测量小鼠体重，排除体重不达标小鼠，以体重大于或等于对照组为筛选标准，体重未达标者提示对肥胖诱导耐受或不敏感，将其淘汰。高脂高糖饮食喂养8周后测量小鼠体重，淘汰肥胖诱导耐受小鼠，测定小鼠空腹血糖，进行口服葡萄糖耐量试验(oral glucose tolerance test，OGTT)，恢复高脂高糖饮食1 d后实验组小鼠禁食16 h，以每天50 mg/kg注射STZ，STZ为0.1%柠檬酸缓冲液(pH 4～5)配制的0.5%STZ注射液，采用白天禁食，夜晚注射的方式，连续注射5 d，末次注射2周后测量空腹血糖，空腹血糖大于16 mmol/L认为中期糖尿病模型构建成功，继续饲养8周采用尿蛋白试纸检测小鼠尿蛋白，然后麻醉下灌流处死小鼠，解剖并取小鼠肾脏进行石蜡切片并染色进行肾脏病理学观察，如出现显著蛋白尿及肾脏病理改变认为DN模型构建成功。

1.2.2血糖测量

使用罗氏血糖仪及血糖试纸，将小鼠固定，用采血针扎入小鼠尾静脉，取尾静脉血进行血糖检测。

1.2.3OGTT

试验前将小鼠夜间空腹12 h，测量空腹血糖，然后将20%葡糖糖溶液以2 g/kg剂量采用小鼠灌胃器进行灌胃，分别于灌胃后30 min、2 h时测量静脉血糖。

1.2.4尿蛋白检测

应用尿蛋白检测试纸采用压迫膀胱方法，在小鼠膀胱充盈时压迫膀胱取小鼠尿液，并滴浸于蛋白测定试纸上，通过标准比色条分析检测结果。

1.2.5病理检查

小鼠在麻醉状态下灌流取肾脏，放入多聚甲醛中固定，经固定组织、脱水、石蜡包埋等步骤，最后用石蜡切片机制作石蜡切片，厚度2 μm。使用过碘酸希夫(PAS)染色及Masson三色染色试剂盒，按试剂盒说明书中步骤对切片进行染色，观察肾脏肾小球、基底膜和系膜基质等病理改变。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 体重变化

2.1.13周龄小鼠

实验组小鼠高脂高糖饮食饲养8周后体重与对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见图1。对照组小鼠体重略大于实验组，实验组小鼠均未达筛选标准，3周龄小鼠未诱导出肥胖。

图1 3周龄小鼠实验组与对照组体重比较

2.1.25周龄小鼠

实验组小鼠饲养8周后体重未达标2只，未诱导出肥胖，将其淘汰；其余4只小鼠体重增加明显，成功诱导出肥胖。实验组肥胖小鼠体重与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，见图2。

a:P<0.05,与对照组比较图2 5周龄小鼠实验组与对照组体重比较

2.2 饲养8周后5周龄小鼠血糖变化

5周龄小鼠实验组高脂高糖饲养8周后空腹血糖明显大于对照组，OGTT在灌胃后30 min时血糖与对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，空腹血糖、餐后2 h血糖与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，实验组小鼠出现早期糖尿病表现，见图3。

图3 5周龄小鼠实验组饲养8周后OGTT与对照组比较

2.3 注射STZ后血糖及症状改变

STZ末次注射2周后实验组小鼠空腹血糖大于16 mmol/L，并出现明显多饮、多食、多尿现象，出现进展期及中期糖尿病表现。

2.4 尿蛋白测定

末次注射STZ 8周后小鼠尿蛋白试纸测定结果为阴性，未出现明显蛋白尿。

2.5 肾脏病理学观察

与对照组比较，实验组小鼠肾脏肾小球、基底膜和系膜基质等病理结构无明显改变，见图4。

A、C：实验组；B、D：对照组；A、B：Masson三色染色；C、D：PAS染色。图4 肾脏病理学观察(400×)

3 讨 论

2型糖尿病为主要的糖尿病类型，其中胰岛素抵抗在2型糖尿病的发生、发展中具有重要作用，在肥胖相关的2型糖尿病中脂肪过度堆积导致体内代偿性分泌胰岛素，过度的胰岛素分泌从而出现胰岛素抵抗[12]；长期高脂高糖饮食、过量高脂高糖食物的摄入损伤胰岛细胞，从而出现糖尿病，长期糖尿病微环境导致肾脏屏障受损及肾脏基底膜增厚并出现肾小球硬化等严重肾脏并发症[13-14]；本研究利用以上原理构建了肥胖相关糖尿病及DN模型。

本研究结果显示，3周龄小鼠难以诱导出肥胖，其原因可能为过早给予高脂高糖饮食，此时小鼠对高脂高糖饮食的消化、吸收能力并未健全，难以诱导出肥胖；5周龄小鼠对高脂高糖饮食敏感，可以较好地诱导出肥胖，并且在高脂高糖饲养8周后空腹血糖、OGTT均与对照组出现了差异，小鼠出现早期糖尿病表现，早期糖尿病模型建立成功，成模率为60%；STZ注射2周后小鼠血糖升高显著(>16 mmol/L)，并且出现明显多饮、多食、多尿表现，糖尿病病情进一步加重，中期糖尿病模型建立成功，成模率为60%。而并发症——DN模型并未构建成功，STZ注射8周后小鼠尿蛋白阴性，且肾脏未见明显病理改变，提示未诱导出DN，DN模型构建失败。

本研究结果提示，C57Bl/6J品系小鼠对高脂高糖饮食较为敏感，可以通过高脂高糖饮食构建早期2型糖尿病模型，并且可以联合STZ注射构建进展期及中期2型糖尿病模型，但该品系小鼠通过高脂高糖饮食联合STZ注射难以诱导出DN模型。