兰国玉 汤守元 黄耿 朱钟钟 李新明 罗海平 姜进平

1鄂东医疗集团黄石市中心医院湖北理工学院附属医院胃肠外科，黄石 435000；2鄂东医疗集团黄石市中心医院湖北理工学院附属医院泌尿外科，黄石 435000

胃癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，是癌症相关死亡的重要原因［1］。胃癌缺乏早期诊断和治疗的标志物，许多患者确诊时已处于晚期，导致胃癌患者的5年总生存率很低［2］。探究新的分子靶点对胃癌的诊疗具有重要意义。微小RNA（miRNA）是一类非蛋白编码的单链小RNA，长度为19～25个核苷酸，可在转录后调控基因的表达［3］。miRNA通过影响细胞的代谢、分化、增殖、侵袭等生物学过程，在胃癌的发生、发展过程中具有重要功能［4］。miR-4795-3p长度为22个核苷酸，其在疾病中的作用尚未见报道。本研究于2020年6月至12月探究miR-4795-3p对胃癌细胞增殖和侵袭能力的影响及可能的调控机制。

材料与方法

1、细胞株与主要试剂

胃癌细胞株BGC823购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库；RPMI-1640培养基购于美国Gibco公司；淋巴细胞增殖检测（MTS）试剂盒购于上海生工生物工程股份有限公司；阴性对照模拟物、miR-4795-3p模拟物、表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）野生型（EGFR-WT）重组质粒、EGFR突变型（EGFR-MT）重组质粒购于上海碧云天生物技术有限公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购于美国Promega公司；Lipofectamine 3000转染试剂、实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）试剂盒购于美国Invitrogen公司；超敏ECL发光试剂盒购于美国Thermo公司；一抗和辣根过氧化物酶标志的二抗购于美国BD公司。

2、细胞培养和转染

BGC823采用含10%胎牛血清RPMI-1640培养基培养于37℃、5%CO2培养箱中，在6孔板接种对数生长期BGC823细胞，采用Lipofectamine 3000试剂转染阴性对照模拟物或miR-4795-3p模拟物，标记为阴性对照组和miR-4795-3p组，12 h后更换培养基。

3、qRT-PCR检测miR-4795-3p、EGFRmRNA表达情况

采用TRIzol法提取两组对数生长期细胞的总RNA，逆转录为cDNA后进行qRT-PCR反应，以U6为miR-4795-3p的内参基因，以GAPDH为EGFR的内参基因，根据2-ΔΔCt法计算miR-4795-3p、EGFR mRNA表达情况。EGFR正向引物：5’-AGGCACGAGTAACAAGCTCAC-3’，反 向 引 物5’-ATGAGGACATAACCAGCCACC-3’；U6正 向 引 物：5’-TGACACGCAAATTCGTGAAGCGTTC-3’，反 向 引 物5’-CCAGTCTCAGGGTCCGAGGTATTC-3’；miR-4795-3p正向引物：5’-CAGAAGTGGCTAATAATA-3’，反向引物5’-CTTCATCAGCGTCAACAG-3’；GAPDH正 向 引 物：5’-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3’，反 向 引 物5’-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3’。

4、MTS法检测BGC823细胞增殖情况

调整两组BGC823细胞密度为6×103个/ml，以200μl/孔接种至96孔板，于第1、2、3、4天检测BGC823细胞的增殖。加入20μl/孔MTS试剂，于培养箱孵育4 h，酶标仪检测每孔于450 nm波长处吸光度（A450）值，绘制BGC823细胞生长曲线。

5、Transwell实验检测BGC823细胞侵袭能力

用不含血清的RPMI-1640培养基调整两组BGC823细胞密度为1×105个/ml，以200μl/孔接种于Transwell上室，在下室加入600μl/孔含血清的培养基，培养24 h后，甲醇固定并采用结晶紫染色，于倒置显微镜下计数细胞侵袭数。

6、生物信息学软件预测和双荧光素酶报告基因实验验证miR-4795-3p的靶基因

采用miRcode数据库预测miR-4795-3p的靶基因，EGFR可能是miR-4795-3p的靶基因。分别将EGFR-WT质粒或EGFR-MT质粒与阴性对照模拟物或miR-4795-3p模拟物共转染至BGC823细胞，48 h后采用双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测每孔BGC823细胞荧光素酶的相对活性。

7、蛋白质免疫印迹试验（Western blot）检测靶基因蛋白的表达

用RIPA裂解液裂解BGC823细胞并提取总蛋白，采用SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白，硝酸纤维素膜转膜。室温封闭后加入一抗，4℃孵育过夜。加入二抗，室温孵育1 h，滴加ECL显影液，采用凝胶成像仪曝光，观察每组蛋白条带。

8、统计学分析

采用SPSS 21.0软件分析数据，符合正态分布的计量资料均以均数±标准差（±s）表示，两组间比较应用独立样本t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1、各组BGC823细胞中miR-4795-3p的表达情况

阴性对照组和miR-4795-3p组BGC823细胞中miR-4795-3p的表达分别为（1.02±0.11）和（11.04±1.23），miR-4795-3p组是阴性对照组的10.82倍，差异有统计学意义（t=8.14，P＜0.01）。

2、高表达miR-4795-3p对BGC823细胞增殖能力的影响

与阴性对照组相比，miR-4795-3p组BGC823细胞在第2、3、4天的A450值显著下降（均P＜0.05），表明miR-4795-3p能够抑制胃癌BGC823细胞增殖能力（图1）。

图1 高表达miR-4795-3p对BGC823细胞增殖能力的影响

3、高表达miR-4795-3p对BGC823细胞侵袭能力的影响

阴性对照组和miR-4795-3p组BGC823细胞细胞侵袭数分别为（79.76±6.27）个和（31.38±5.46）个，差异有统计学意 义（t=5.82，P＜0.01），提示miR-4795-3p可抑制胃癌BGC823细胞的侵袭能力。

4、双荧光素酶报告基因实验验证miR-4795-3p的靶基因

双荧光素酶报告基因实验显示，阴性对照+EGFR-WT组和miR-4795-3p+EGFR-WT组BGC823细胞相对荧光素酶活性分别为（1.01±0.08）和（0.22±0.05），差异有统计学意义（t=8.58，P＜0.01），提示miR-4795-3p可靶向结合EGFR。

5、高表达miR-4795-3p对EGFRmRNA表达水平的影响

阴性对照组和miR-4795-3p组BGC823细胞中EGFR mRNA的表达分别为（1.00±0.03）和（0.35±0.04），证实miR-4795-3p可直接下调EGFR mRNA的表达（t=14.08，P＜0.01）。

6、高表达miR-4795-3p对EGFR蛋白的表达

Western blot结果表明，与阴性对照组相比，miR-4795-3p组BGC823细胞EGFR蛋白减少，EGFR/MAPK信号通路蛋白如p-MEK、p-ERK表达降低（图2）。

图2 高表达miR-4795-3p对EGFR蛋白表达的影响

讨 论

研究表明，miRNA由具有发夹结构的miRNA前体通过Dicer酶加工合成，其表达具有明显的细胞特异性［5］。miRNA通过表现为癌基因或抑癌基因作用，其上调或下调与胃癌的发生和发展密切相关［6］。miRNA如miR-665［5］、miR-129-5p［7］等通过负性调控癌基因的表达，抑制胃癌的生长和转移。miRNA如miR-301a-3p［8］、miR-223-5p［9］等通过下调抑癌基因的表达，促进胃癌的生长和转移。miR-4795-3p在胃癌细胞中的作用并不清楚。本研究表明，高表达miR-4795-3p可显著抑制胃癌BGC823细胞的增殖和侵袭能力，miR-4795-3p在胃癌细胞中发挥抑癌基因作用。

miRNA与靶基因mRNA的3’非翻译区互补配对，诱导靶基因mRNA的降解或抑制蛋白合成，进而在转录后水平负性调控靶基因的表达［6］。本研究应用生物信息学软件miRcode数据库预测显示，miR-4795-3p和EGFR mRNA存在互补配对的反应元件。EGFR蛋白是一种糖蛋白，其在多种实体瘤中过表达，可促进肿瘤细胞的增殖、侵袭及血管生成［10］。高表达的EGFR与胃癌的淋巴结转移、临床分期呈正相关，是食胃癌患者的独立预后因素，EGFR参与胃癌的发生、发展过程［11］。双荧光素酶报告基因实验显示，miR-4795-3p可互补配对结合EGFR mRNA。本研究进一步证实，转染miR-4795-3p后细胞中EGFR表达下降，表明miR-4795-3p可靶向负调控EGFR的表达，EGFR是miR-4795-3p的靶基因。EGFR/MAPK信号通路的激活可促进胃癌细胞的增殖和侵袭［12］。本研究显示，miR-4795-3p下调EGFR表达后，BGC823细胞中EGFR/MAPK信号通路蛋白如p-MEK、p-ERK表达降低，EGFR/MAPK信号通路被抑制。

综上所述，miR-4795-3p能够通过靶向负调控EGFR表达，干扰EGFR/MAPK信号通路，抑制胃癌细胞的增殖和侵袭能力，本研究为miRNA在胃癌的靶向治疗研究提供了理论基础。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突