赵双枝宋国宾裘纪莹张彦昊陈蕾蕾李熙文周庆新袁玮杨金玉

(1.中国海洋大学海洋生命学院，山东 青岛 266003；2.山东省农业科学院农产品加工与营养研究所/山东省农产品精深加工技术重点实验室/农业农村部新食品资源加工重点实验室，山东 济南 250100；3.山东师范大学生命科学学院，山东 济南 250014)

牛蒡(Arctium lappaL.)是菊科牛蒡属两年生草本直根类植物，又名“蝙蝠刺”“蒡翁菜”“东洋牛鞭菜”等。牛蒡喜生长在光照强、土壤深厚疏松、气候温润潮湿的地方[1，2]。我国大部分地区均有种植，栽培区域主要在山东、江苏、浙江、湖北、安徽、甘肃等地区[3]。牛蒡富含菊糖、蛋白质、钙等营养成分及多种维生素、17种氨基酸，有较高的药用和食用价值[4，5]。牛蒡叶、子、根均可作药用[6，7]。牛蒡叶具有抗炎、疏风散热、抗病毒等作用[8，9]；牛蒡子具有抗炎、抗病毒、免疫调节活性等[10，11]；牛蒡根的主要功效包括降脂、调节胃肠功能及提高机体代谢率等[12，13]。

近年来，国外对我国牛蒡根的需求量逐渐增加，但在对外出口的牛蒡根中会产生约10 t/hm2的不合格产品，主要作为废弃物处理[14]；同时，在我国牛蒡根精深加工过程中会产生大量的下脚料。为提高经济价值、避免资源浪费与环境污染，牛蒡根下脚料的综合利用与开发具有深远意义。研究不同产地牛蒡根下脚料的化学成分组成，旨在筛选出适合赤芝发酵的培养基质，通过赤芝－牛蒡根下脚料双向发酵体系的建立，提高发酵菌质某些营养成分、功效成分及风味，以期开发出功能性牛蒡灵芝茶等饮品，既可解决牛蒡下脚料废弃、腐烂引起的资源浪费和环境污染问题，又可提高该资源经济价值。

1 材料与方法

1.1 供试材料

牛蒡根下脚料分别从山东安丘、江苏徐州、安徽亳州、山东兰陵、甘肃陇南及山东青岛城阳地区农户手中采集，是牛蒡根加工过程中产生的破碎料、残根、碎屑等废弃物，经清洗、切碎后于65℃烘箱烘干备用。赤芝(Ganoderma lucidum)菌种CICC 50006由山东省农业科学院农产品加工与营养研究所食品微生物团队分离、保存。

1.2 试验方法

1.2.1 菌种活化和种子培养基 PDA培养基经121℃高压灭菌30 min后制成试管斜面备用。无菌条件下剖取小块母种(1 cm2)，移接到斜面活化培养基，27℃恒温培养，待菌丝长满斜面后置于4℃保存备用。种子培养基为20%土豆汁、3%麦麸、3%葡萄糖、0.2%磷酸二氢钾、0.1%硫酸镁，自然pH。

1.2.2 牛蒡根下脚料预处理及发酵 将牛蒡根下脚料水中浸泡2 h，利用脱水机脱水，水分含量控制在65%，按300 g/袋装袋，121℃灭菌2 h。赤芝接种量为10%，发酵温度为26℃，分别于培养第7、10、13、16、19天取样，粉碎后测定营养和功效成分。

1.2.3 固态发酵基质的筛选 检测安丘、徐州、亳州、兰陵、陇南、城阳6个地区牛蒡根下脚料中氨基酸总量、蛋白质、类黄酮、总糖、还原糖、菊糖、总三萜酸、核苷、挥发性物质种类和含量以及抗氧化活性。综合赤芝菌生物学特性及对主要营养物质的需求，筛选出最优的固态发酵基质。

1.2.4 营养成分和功能成分测定 蛋白质含量:将烘干后的样品粉碎，参照GB 5009.5—2016《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》(凯氏定氮法)。

氨基酸含量:将烘干、粉碎后的样品进行盐酸酸解，参照GB 5009.124—2016《食品安全国家标准 食品中氨基酸的测定》。

多糖含量:精密称取烘干、粉碎均匀样品1 g于具塞试管中，加入25 mL纯水，沸水浴提取2 h，冷却过滤后残渣用20 mL纯水再提取1 h，合并滤液，定容至50 mL，充分摇匀。采用苯酚硫酸法，参照刘夕娟等[15]的试验方法进行测定。

还原糖含量:采用DNS试剂法，参照刘夕娟等[15]的试验方法进行测定。

菊糖含量:根据总糖和还原糖标准曲线分别计算样品中两者的含量，然后根据公式计算菊糖含量。菊糖含量＝总糖含量－还原糖含量。

总三萜酸含量:参照刘超[16]的方法进行测定。精密称取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL齐墩果酸标准品溶液于8支具塞试管中，水浴加热挥发掉溶剂；分别向每支试管中加5%香草醛－冰醋酸溶液0.3 μL、高氯酸1 mL，密封；70℃水浴恒温加热25 min，取出后立即冰水冷却，加冰醋酸10 μL，摇匀，550 nm处测定吸光值，以吸光度(A)为纵坐标、齐墩果酸浓度(C)为横坐标绘制标准曲线，其回归方程为A＝0.8633C，R2＝0.9991。粉碎后的样品于40℃烘箱烘8 h，精密称取各样品2.0 g，放入具塞三角瓶中，加乙醇40mL，超声30 min，过滤，滤渣加入无水乙醇30 mL，超声30 min，过滤，用乙醇冲洗滤渣数次，滤液定容于100 mL，待测。精密吸取各供试品溶液0.2 mL，重复3次，按照上述标准曲线步骤操作测定吸光值，根据标准曲线计算浓度(mg/g)。

核苷含量:参照王金艳等[17]的方法进行测定。精密称取粉碎后均匀的样品1 g于10 mL具塞试管中，加入10 mL蒸馏水，混匀后超声(500W，40 kHz)提取1 h。将试管取出后冷却至室温，混匀，4 000 r/min离心10 min，吸取上清液过0.45 μm微孔滤膜并转移至样品瓶中，进行HPLC分析，绘制核苷标准曲线，对发酵前后核苷含量进行测定。

色谱条件:色谱柱为Aglient HC－C18柱(4.6mm×250 mm，5 μm)。流动相(甲醇－水)梯度洗脱程序:0→20 min，甲醇5%，水95%；20→35 min，甲醇20%，水80%；35→36 min，甲醇5%，水95%；36→40 min，甲醇5%，水95%。紫外检测器，波长259 nm，柱温30℃，流速1.0 mL/min，进样量10 μL。

1.2.5 挥发性物质种类和含量测定 参照屠玥之等[18]的方法进行测定。称取各待测样品2.00g左右于顶空瓶中，加入5 mL蒸馏水、5 μL四甲基二戊醇，混匀，于65℃条件下将65 μm PDMS/DVB纤维萃取头插入顶空瓶中萃取30 min，拔出萃取头插入GC－MS进样口中，220℃脱附2 min，进行GC－MS分析，得到质谱图，由ChromaTOF软件系统完成质谱分析。化合物检索谱库:NIST谱库。以各挥发性组分的峰面积占总面积之比表示组分相对含量。

色谱条件:DB－Wax毛细管柱(60 m×320 μm×0.15 μm)；进样口温度220℃；载气:氦气(纯度＞99.999%)；流速1 mL/min；分流进样。升温程序:50℃保持3 min，以3℃/min升温至120℃并保持3 min，以5℃/min升温至250℃并保持10 min；总分析时间为62 min。质谱条件:离子源为EI；电离能量:－70 eV；质量扫描范围:33～600 u；离子源温度:200℃；传输线温度:250℃。

1.3 数据统计与分析

使用SPSS 26.0的ANOVA法进行单因子方差分析，统计各处理组之间的差异性，试验数据用平均值±标准误表示，P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 不同地区牛蒡根下脚料营养成分和功效成分测定结果

2.1.1 不同地区牛蒡根下脚料营养成分含量由表1可知，安丘地区牛蒡根下脚料中氨基酸总量最高，达104.0 g/kg，与亳州地区的差异不显著，但显著高于其它地区。安丘地区牛蒡根下脚料中蛋白质含量最高，达117.9 g/kg，显著高于其它地区。安丘地区牛蒡根下脚料中总糖和菊糖含量最高，分别达0.72、0.66 g/g，与陇南地区的差异不显著，但显著高于其它地区。可见，不同地区的牛蒡根下脚料中营养成分含量存在较大差异。

表1 不同地区牛蒡根下脚料营养成分含量

由表2可知，亳州、陇南地区牛蒡根下脚料均未检出胞苷，各地区均未检出鸟苷、肌苷及腺苷，安丘地区牛蒡根下脚料尿苷、核苷总量最高，显著高于其它地区。

表2 不同地区牛蒡根下脚料中核苷含量(μg/g)

2.1.2 不同地区牛蒡根下脚料功效成分含量由表3可知，安丘地区牛蒡根下脚料中类黄酮含量最高，达6.72 mg/g，显著高于其它地区。青岛城阳地区总三萜酸含量最高，与兰陵地区差异不显著，但显著高于其它地区。

表3 不同地区牛蒡根下脚料功效成分含量 (mg/g)

2.1.3 不同地区牛蒡根下脚料中挥发性物质种类和含量 表4表明，安丘地区牛蒡根下脚料样品中共检测到挥发性物质108种，相对含量达78.47%，亳州和兰陵样品的总挥发性物质种类也较多，相对含量也较高。在挥发性物质中，醛类、氮杂环化合物、醇类、有机酸类化合物的相对含量普遍较高。安丘地区样品中检测到醛类化合物23种，相对含量26.35%；氮杂环化合物19种，相对含量12.76%；醇类化合物11种，相对含量7.31%；有机酸类化合物8种，相对含量10.28%；烯类化合物9种，相对含量5.57%。

表4 不同地区牛蒡根下脚料中挥发性成分种类及含量

综上，安丘地区牛蒡根下脚料中氨基酸总量、蛋白质含量、类黄酮含量、总糖和菊糖含量、核苷总量等营养和功效成分以及挥发性物质的种类和相对含量均最高，故选择安丘地区牛蒡根下脚料为原料制备固态发酵基质，开展下一步的发酵试验。

2.2 未发酵样品及发酵菌质营养成分、功效成分和挥发性成分组成及含量分析

2.2.1 发酵前后营养成分含量分析 如表5所示，与未发酵样品相比，发酵菌质氨基酸总量显著下降，蛋白质含量显著上升，说明赤芝菌丝体利用牛蒡根下脚料中的营养物质转化合成了菌体蛋白。发酵菌质中总糖、菊糖含量显著降低，还原糖含量显著升高，说明赤芝在发酵过程中能分解牛蒡根下脚料中的糖类，以满足自身生长繁殖需要，并且进行生物转化。

表5 牛蒡根下脚料发酵前后营养成分含量比较

如图1所示，未发酵样品中不含鸟苷、肌苷、腺苷，经过发酵合成了上述核苷。未发酵样品胞苷、尿苷及核苷总量较低，发酵后显著性增加(P＜0.05)，核苷总量达到2 637.14 μg/g。

图1 牛蒡根下脚料赤芝发酵前后核苷含量

2.2.2 发酵前后功效成分含量分析 如图2所示，与未发酵样品相比，牛蒡根下脚料赤芝发酵菌质中总三萜酸含量显著提高(P＜0.05)，其中发酵第13、16天含量最高，说明牛蒡根下脚料赤芝发酵过程中能够产生三萜酸类化合物。发酵前样品中类黄酮含量为6.72 mg/g，发酵后未检测出。

图2 牛蒡根下脚料发酵前后总三萜酸含量

2.2.3 发酵前后挥发性成分组成及含量分析由表6可以看出，发酵第16天菌质中总挥发性成分种类由未发酵样品中的108种减少到73种，但总挥发性成分的相对含量由78.47%增加到162.21%，说明经过发酵可去除原料本身的某些挥发性成分，同时赋予其更浓郁的香味，尤其是醛类、酮类和氧杂环类化合物的相对含量大幅提高。

表6 未发酵样品和发酵菌质中挥发性成分种类及其含量

3 讨论

牛蒡根中含有类黄酮、三萜酸类、核苷等多种小分子功效成分[19]，还具有醇、烯、醛、酮、酚、烷烃、有机酸、酯、氮杂环及氧杂环等挥发性成分[20]。不同地区牛蒡根下脚料中蛋白质、氨基酸、总糖、还原糖和核苷的含量差异较大。时新刚等[21]报道，山东兰陵地区每100 g鲜牛蒡根中含有2.1 g蛋白质。本试验结果显示，兰陵地区牛蒡根下脚料中蛋白质含量为110.5 g/kg，这可能是由于牛蒡品种、干鲜程度不同造成的。何虎翼等[22]研究证实，不同品种牛蒡根的营养成分差异较大。牛蒡根中氨基酸含量较高，约占干重的28%，其中精氨酸含量最高[23]。胡喜兰等[24]研究发现，新疆伊犁、石河子两个地区牛蒡根(干料)的氨基酸总量基本相同，分别为112.0、123.9 g/kg，与本试验中安丘地区样品相近，这表明牛蒡根下脚料含有较高的氨基酸，具有较高的再利用价值。徐孝梁等[25]研究表明，牛蒡根中菊糖含量与年均温和土壤有机质含量无明显相关性，与年日照量存在正相关关系，与年降水量和年相对湿度存在负相关性。

赤芝作为木腐真菌，菌丝体活力较高，分解能力较强。牛蒡根下脚料经过赤芝发酵后，氨基酸总量显著降低，可能是由于赤芝菌在生长过程中利用牛蒡根下脚料中的氨基酸成分，以满足自身生长，同时转化合成其它物质，从而造成了氨基酸总量的降低。高文庚等[26]对灵芝发酵粉基质进行优化，使氨基酸质量分数增加了7%，与本试验结果有一定差异，可能是本试验发酵过程中没有外源营养物质添加的原因。有研究报道采用灵芝－牛蒡根发酵后，菌质蛋白质含量显著升高[27]；采用灵芝－枇杷叶发酵后，菌质总蛋白平均增长率为43.60%[28]。这与本试验结果一致，可能是因为发酵过程中赤芝菌丝体生长产生了新的菌体蛋白。在本试验中，发酵后总糖和菊糖显著降低，核苷总量显著升高，且合成了新的腺苷，与张命龙等[27]的结论一致。发酵后还原糖含量升高，这可能是由于赤芝菌丝体分解总糖生成还原糖。表明牛蒡根下脚料经赤芝菌丝体发酵后营养成分发生了较大改变，体现了真菌发酵牛蒡根下脚料的双向效果。

类黄酮化合物普遍存在于植物体内的生物合成途径中，而且可产生极其丰富的次生代谢物[29]，因具有清除自由基、抑菌等多种功能而受到广泛关注。在本试验发酵菌质中未检测出类黄酮物质，而未发酵样品中类黄酮含量为6.72 mg/g，说明发酵后类黄酮含量显著降低，这与前人的研究结果一致[28]，表明类黄酮物质可能在牛蒡根下脚料－赤芝发酵过程中被赤芝菌丝体代谢利用转化为其它物质，今后需进一步探究其转化机制。三萜酸类化合物广泛存在，枇杷叶、茯苓、牛蒡根中都含有三萜酸成分，是赤芝的主要生理活性成分，具有明显的免疫调节、抗炎、抗病毒等功能[30]。本试验中，未发酵基质中总三萜酸含量极低，仅为0.09 mg/g，发酵第16天菌质中总三萜酸含量最高，为0.23 mg/g，这说明赤芝菌丝体可能通过生物转化机制，利用牛蒡根下脚料中的营养物质、活性物质等合成三萜类化合物，也与前人研究结果[31]一致。

本试验中，牛蒡根下脚料经过赤芝菌丝体发酵后挥发性物质种类减少，但总成分相对含量显著提升。

4 结论

本研究中山东安丘地区牛蒡根下脚料的氨基酸、蛋白质、总糖、菊糖、核苷、类黄酮含量及挥发性物质种类和相对含量高于其它产区，适合作为赤芝发酵的固态基质。牛蒡根下脚料经过赤芝固态发酵，明显提高了菌质的营养成分和功效成分含量，同时去除了难闻、刺鼻气味，更好地呈现了愉悦的香味，为牛蒡根下脚料的综合利用和功能性牛蒡灵芝茶饮品的开发提供了理论依据和技术支撑。