王振宝，杨妍妍，刘冰江，霍雨猛，李艳伟，孙亚玲，吴雄

(山东省农业科学院蔬菜研究所，山东 济南 250100)

洋葱(Allium cepaL.)又名圆葱、葱头、球葱等，为百合科葱属二年生草本植物。洋葱于二十世纪初期引入我国，具有适种性广、易栽培的特点，我国南北方均有栽培，目前我国洋葱的生产面积和产量均居全球第一，约占世界洋葱生产总面积的30%左右，是重要的出口创汇蔬菜[1]。洋葱以肉质鳞茎为主要食用器官，是黄酮醇类化合物的重要食物来源。黄酮醇类化合物一般具有较强的抗氧化性[2]，起到抑菌抗炎、抗过敏、保护心血管、防癌等作用[3]。

黄酮类化合物作为重要的次生代谢物广泛存在于植物中，可以保护植物免受生物和非生物胁迫的危害[4，5]。因其分子中含有酮基而呈现黄色，从而赋予植物花、果实、种子等组织器官不同的颜色。黄酮醇类化合物是最为常见的黄酮类化合物，占黄酮类化合物总数的1/3左右，是洋葱鳞茎产生黄色的主要因素。黄酮醇合成酶(flavonol synthase，FLS)是黄酮醇生物合成的直接调控酶，也是连接类黄酮类合成途径和儿茶素合成途径的桥梁，它以二氢黄酮醇为底物，催化黄酮结构中的C3位发生羟基化形成各种黄酮醇类物质[6，7]。黄酮醇合成酶在植物中非常保守[8]，汪庆昊等[9]根据FLS基因保守区域的序列设计引物，成功克隆了杜鹃FLS基因的全长序列。目前已经从葡萄风信子[10]、青天葵[11]、日本蛇根草[12]等植物中分离、克隆了FLS基因。

关于洋葱花青素合成途径相关基因的研究已经较为成熟，目前已经克隆了CHI、DFR、ANS、UFGT等基因并做了详细研究[13－17]，但是关于洋葱FLS基因的研究相对较少。Park等[18]克隆了洋葱的FLS基因，并对3个月苗期红皮和黄皮洋葱中FLS基因对底物的催化效率、FLS基因及花青素生物合成途径基因的表达水平做了研究。本研究克隆了洋葱FLS基因的编码序列，并进行了生物信息学分析，同时对其在不同皮色洋葱的不同组织及鳞茎膨大期的表达情况进行了研究，以期为揭示洋葱鳞茎颜色的形成机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以黄皮洋葱DH17－1未开放花蕾为试材，克隆FLS基因。取样后立即用液氮速冻，于－80℃冰箱中冻存备用。

以紫皮洋葱175F和黄皮洋葱DH17－1为试材，选取鳞茎膨大前的根、叶鞘和叶片以及鳞茎膨大初期、盛期、末期和收获期的外层肉质鳞片用于FLS基因的表达分析。蒸馏水冲洗干净后，分别用锡箔纸包好，立即用液氮速冻，于－80℃冰箱中冻存备用。

1.2 洋葱总RNA的提取及cDNA的制备

洋葱总RNA采用Trizol(Invirtrogen公司)法提取，具体方法参照说明书。参照反转录试剂盒PrimeScriptTMRT reagent kit with gDNA Eraser[宝生物工程(大连)有限公司]说明书反转录合成cDNA第一链。

1.3 PCR扩增

克隆洋葱FLS基因的正向引物为FLS－F:5′－CATCAGAGTTCATCAGATCGGACCA－3′，反向引物为FLS－R:5′－GCATAATCTTTGTATTTTTTGGTCT－3′，由青岛蔚来生物科技有限公司合成。

PCR反应体系(25 μL):模板(cDNA)1 μL，dNTPs(2.5 mmol/L)4 μL，10×LATaqbuffer 2.5 μL，引物各1 μL，TaKaRa LATaq0.25 μL，灭菌ddH2O补齐至25 μL；扩增程序:94℃预变性5 min；94℃变性30 s，63℃退火30 s，72℃延伸1 min，35个循环；最后72℃保温10 min，4℃保存。扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳分离，然后在凝胶成像系统上检测并拍照记录。

将目的片段切胶回收，送青岛蔚来生物科技有限公司测序。

1.4 数据分析

利用NCBI在线进行开放阅读框的查找和结构域分析；分别利用ProtParam、NetPhos－3.1、ProtScale、SOPMA、SWISS－MODEL和ProtComp 9.0进行蛋白质理化性质分析、磷酸化位点预测分析、亲疏水性分析、二级结构预测、三级结构预测和亚细胞定位；分别利用Blastp、DNAMAN进行氨基酸同源序列检索和氨基酸序列比对。

1.5 基因表达模式分析

利用Primer 5.0设计AcFLS基因的实时荧光定量PCR引物，正向引物AcFLS－F:5′－CCTGGGTTGATTACTTGTTTC－3′，反向引物AcFLSR:5′－CTTGTTTACCGTTGTTCTGTG－3′，分析仪器为Bio－Rad CFX96 Touch荧光定量PCR仪。PCR扩增体系:2×SYBR Green qPCR Master Mix 10.0 μL，正、反向引物各1.0 μL，cDNA模板1.0 μL，灭菌ddH2O补齐至20 μL。PCR反应程序采用三步法:95℃预变性3 min；95℃变性10 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，40个循环；熔解曲线制备温度为65.0～95.0℃。

每个样品进行3次生物学重复，以β－Actin基因为内参，正向引物Actin－F:5′－ACACGGCCTGGATAGCAACAT－3′，反向引物Actin－R:5′－AGAGCAGTATTCCCAAGCATT－3′。目的基因相对转录表达水平参照Livak等[19]的方法，采用2－ΔΔCt公式进行计算。

2 结果与分析

2.1 洋葱FLS基因的克隆及生物信息学分析

以洋葱未开放花蕾cDNA为模板，通过RTPCR方法克隆得到了洋葱FLS基因的cDNA序列，片段大小约950 bp(图1)，命名为AcFLS。NCBI在线网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)预测AcFLS共有11条开放阅读框，其中最大的一条为927 bp，编码309个氨基酸。利用ProtParam对AcFLS基因编码的蛋白质进行理化性质分析，AcFLS编码蛋白质的分子式为C1605H2467N419O462S7，总原子数为4 960，分子量为35 249.19 Da，理论等电点(pI)为6.20，负电荷残基(Asp＋Glu)总数为40，正电荷残基(Arg＋Lys)总数为35，脂肪系数84.47，不稳定指数42.35，为不稳定蛋白，平均亲水性(GRAVY)为－0.515，预测为亲水性蛋白。

图1 洋葱FLS基因RT－PCR电泳图

2.2 AcFLS蛋白磷酸化位点及亲疏水性分析

蛋白质磷酸化是蛋白活力和功能的重要调节方式，在细胞信号的传递过程中起到极其重要的作用。利用NetPhos－3.1(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetPhos－3.1)进行Ac-FLS蛋白磷酸化位点预测，结果显示，AcFLS蛋白共有12个Ser磷酸化位点、7个Thr磷酸化位点、8个Tyr磷酸化位点(图2)。

图2 AcFLS蛋白氨基酸序列及磷酸化位点

ProtScale(https://web.expasy.org/protscale/)亲疏水性分析结果表明(图3)，AcFLS蛋白存在6个低分值峰(Score＜－2)，分别分布于0～50、100～150、250～300和300～309氨基酸之间，这些区域属于亲水性区域；2个高分值峰(Score＞1.5)，分布于200～250氨基酸之间，属于高疏水性区域。从整条肽链的氨基酸预测值来看，AcFLS蛋白处于亲水性区域明显多于疏水性区域，所以该蛋白为亲水性蛋白质，这与ProtParam的预测结果一致。

图3 AcFLS蛋白亲疏水性分析

2.3 AcFLS蛋白结构域分析

通过NCBI Conserved Domains(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)进行结构域分析，AcFLS蛋白的保守功能域预测如图4所示，该蛋白包含3个功能域，其中1～309氨基酸为PLN02704超级家族结构域，该功能域为黄酮醇合成酶功能域，说明其具有黄酮醇合成酶的功能。此外，184～282氨基酸为一个2OG－Fe(Ⅱ)－Oxy功能域，属于2OG－Fe(Ⅱ)加氧酶家族，27～301氨基酸为一个PcbC超级家族功能域，表明AcFLS蛋白属于α－同戊二酸依赖性双加氧酶超家族。

图4 AcFLS蛋白保守结构域分析

2.4 AcFLS蛋白同源性分析

利用Blastp对AcFLS氨基酸序列进行同源检索，发现AcFLS蛋白氨基酸序列与已报道洋葱FLS蛋白(登录号:AQR58516.1)同源性最高，为91.34%，与同为百合科的虎眼万年青FLS蛋白(登录号:QBQ58059.1)的同源性为76.42%，与石刁柏FLS蛋白(登录号:XP＿020241901.1)的同源性为74.63%。进一步说明克隆得到的为洋葱FLS基因。

通过DNAMAN将AcFLS基因完整开放阅读框编码的氨基酸序列与其它植物FLS氨基酸序列进行比对，结果表明AcFLS蛋白氨基酸序列与其它植物FLS氨基酸序列同源性平均值为82.16%，并且具有相似的保守域，特别是红色方框标注的2OG－Fe(Ⅱ)加氧酶结构域，在不同植物中具有高度同源的氨基酸序列，该功能域含有3个高度保守的氨基酸序列，分别为与亚铁离子结合的H－X－D、H－X序列以及与2－酮戊二酸结合的R－X－S序列(X代表任意氨基酸，图5)。

图5 不同植物FLS蛋白氨基酸序列比对分析

2.5 AcFLS蛋白结构预测及亚细胞定位

SOPMA(http://npsa－pbil.ibcp.fr/cgi－bin/npsa＿automat.pl?page＝npsa＿sopma.html)在线预测分析结果显示(图6)，AcFLS蛋白的二级结构主要为无规则卷曲、α－螺旋、延伸链和β－折叠结构，占比分别为46.28%、28.16%、20.06%和5.50%，说明AcFLS蛋白是由多种元件组成的混合结构型蛋白质。利用在线工具SWISS－MODEL得到AcFLS蛋白的三级结构，一致度为45.45%，GMQE值为0.84，可信度接近1，表明所建模型的可靠度较高(图7)。

图6 AcFLS蛋白二级结构预测图

图7 AcFLS蛋白三级结构模拟图

利用ProtComp 9.0在线预测AcFLS蛋白的亚细胞定位，分析结果表明该蛋白位于细胞质的积分值高达8.67(图8)，推断AcFLS蛋白极大可能定位于细胞质中。

图8 AcFLS蛋白亚细胞定位

2.6 AcFLS基因表达分析

以β－Actin基因为内参，采用实时荧光定量PCR对紫皮、黄皮洋葱鳞茎膨大前根、叶鞘、叶片及鳞茎膨大各时期AcFLS基因的表达情况进行分析。结果显示，AcFLS基因在洋葱不同组织部位的表达存在明显差异，叶鞘中表达量最高，叶片次之，根中表达量极少(图9)；AcFLS基因在洋葱鳞茎不同膨大时期的相对表达量呈先升高后降低的趋势，在鳞茎膨大盛期达到最高值(图10)。但是，无论不同组织部位还是鳞茎不同膨大时期，紫皮和黄皮洋葱中AcFLS基因的表达水平并无显著差异。

图9 AcFLS基因在不同皮色洋葱不同组织中的相对表达量

图10 AcFLS基因在不同皮色洋葱鳞茎膨大各时期的相对表达量

3 讨论与结论

目前在众多植物中的研究表明，FLS基因与黄酮醇的合成和积累直接相关，并且能够影响植物花青素的生物合成和积累，FLS是黄酮类化合物合成代谢下游的关键酶，不同植物的FLS具有较高的保守性，其中比较典型的保守序列是RX－S、H－X和H－X－D序列[20－22]。本研究克隆了洋葱FLS基因编码序列，通过分析其编码蛋白的氨基酸序列，发现与其它植物FLS蛋白氨基酸序列的同源性为82.16%，AcFLS蛋白还包含FLS家族成员的大部分特征，比如包含2OG－Fe(Ⅱ)加氧酶结构域、PcbC超级家族功能域以及2OG－Fe(Ⅱ)结构域中与亚铁离子结合的H－X－D、H－X序列和与2－酮戊二酸结合的R－X－S序列。这与在苹果、紫山药和罗布麻[23－25]中FLS蛋白的分析结果一致，说明FLS家族蛋白的氨基酸序列保守性较高，特别是一些涉及蛋白功能的位点，保证了FLS基因在不同物种间生物学功能的稳定性。

实时定量表达分析结果表明，AcFLS基因的表达具有明显的组织特异性，表现为叶鞘中表达量最高，叶片次之，根中表达量极低；AcFLS基因在洋葱鳞茎膨大期的表达量呈现先升高后降低的趋势，在鳞茎膨大盛期达到最高值。这与葡萄风信子MaFLS基因的表达模式相似，MaFLS基因在花中的表达强度最高，其次是叶，根和茎中表达量最低[26]。在叶鞘和鳞茎中AcFLS基因表达量高，推测这可能是因为鳞茎(叶鞘)为营养储藏器官，需要积累大量黄酮醇类化合物；同时在叶片中也检测到AcFLS基因的表达，可能是叶片中合成黄酮醇类化合物以抵御太阳辐射等非生物胁迫的危害。本研究还发现AcFLS基因在紫皮和黄皮洋葱中的表达量并无显著差异，这与Park等[18]的研究结果一致。这可能是因为黄酮醇类化合物是洋葱正常生长发育的重要物质，也是其抗逆、抗胁迫应答机制的重要组成成分，在不同皮色洋葱中均需要一定数量黄酮醇类物质的存在；而且植物黄酮醇的合成不仅与FLS基因的表达有关，同时还受UV－B、光等多种环境因素的影响[27]。

FLS基因是影响植物花青素合成和积累的重要基因，本研究克隆了洋葱FLS基因，并对其氨基酸序列进行了生物信息学分析，同时研究了不同皮色洋葱中FLS基因的表达情况，为进一步研究洋葱FLS的生物学功能以及洋葱鳞茎颜色产生的分子机制奠定了基础。为了进一步弄清洋葱鳞茎颜色产生的机制，下一步需克隆洋葱MBW转录调控因子以及颜色抑制基因I和基本颜色基因C，同时研究花青素合成途径相关基因转录情况以及类黄酮的种类和含量。