基于RNA-Seq技术分析微囊藻毒素-LR对草鱼肝脏脂质代谢的影响

2022-02-04林长高隗黎丽

江西农业大学学报 2022年1期

林长高，刘林，王辉，隗黎丽

（江西农业大学动物科学技术学院，江西南昌 330045）

【研究意义】目前普遍认为鱼类的生理和物种差异、遗传和基因突变、营养素摄入不均衡、能量摄入过度以及养殖环境中污染物可干扰鱼类的脂质代谢，从而造成鱼类脂肪严重沉积[1]。结合现有的研究报道，学者们主要从营养与饲料的角度对鱼类脂质代谢进行了研究，而环境污染物影响鱼类脂质代谢的研究相对较少。近年来，随着水体环境污染日益严重，养殖水体中的环境污染物对养殖鱼类脂肪沉积的影响也引起了研究者们的重视。【前人研究进展】微囊藻毒素（microcystins，MCs）是富营养化水体中有毒蓝藻细胞所产生的一类具有生物活性的环状七肽化合物，也是水体环境常见的污染物。到目前为止，发现已知结构的MCs 变体多达100 余种，其中微囊藻毒素-LR（microcystins-LR，MC-LR）是目前已知的毒性最强的一种淡水蓝藻毒素[2]。MC-LR 的主要作用靶器官是肝脏，有关MC-LR 肝毒性的机制已经成为学术界研究的热点问题。Wu等[3]研究表明MC-LR 可诱导小鼠肝脏原代细胞中ROS的过量产生，导致肝细胞氧化损伤、凋亡及坏死。Zhan等[4]则指出MC-LR 可触发斑马鱼肝脏内质网应激反应，引起肝脏细胞凋亡。亦有研究表明MC-LR 暴露可对小鼠肝脏不饱和脂肪酸的生物合成及PPAR 代谢通路造成影响，最终导致脂质代谢紊乱[5]。【本研究切入点】在笔者之前的研究中，根据转录组测序结果主要对免疫及凋亡相关的通路及基因进行了报道[6]，然而深入挖掘数据发现，MC-LR 对草鱼肝脏脂质代谢也有明显的影响。【拟解决的关键问题】本研究结合前期已获得MC-LR 诱导后草鱼肝脏转录组测序数据[6]，重点对脂质代谢相关通路和差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs）进行深入分析，为进一步了解MCLR对鱼类脂质代谢的影响提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料及主要试剂

试验用草鱼购于江西省南昌神龙渔业公司，平均体质量为（22.13±2.17）g。试验草鱼买回后先在室内暂养2 周，暂养期间每日按照鱼体质量的2.0%进行投喂，并保持水温在（20±0.2）℃。实验用MC-LR（纯度≥95%），购自Taiwan Algal Science Inc 公司，RNA 提取试剂盒TRIzol reagent 购于Invitrogen 公司，逆转录试剂盒RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit 和SYBR Green Real-time PCR Master Mix 购于Promega公司。

1.2 试验方法

1.2.1 试验鱼处理及样品采集草鱼在实验室暂养2 周后，挑选体质健康的草鱼随机分成4 个组（包括1 个对照组和3 个MC-LR 实验组），每组设3 个平行组。随后将购买的MC-LR（纯度≥95%，Taiwan Algal Science Inc）用0.8%生理盐水溶解稀释成25，75，100µg/kg 3 个剂量。采用腹腔注射染毒，注射量为0.1 mL/尾；对照组每尾草鱼经腹腔注射等量的0.80%的生理盐水。在染毒96 h 后，分别从实验组和对照组中各取6 尾鱼分离肝脏，每个组3 尾鱼混合成1 个样置于液氮中保存。

1.2.2 转录组测序与分析取液氮中保存的草鱼肝脏组织按照TRIzol reagent（Invitrogen）操作说明进行总RNA 的提取，用15 g/L 的琼脂糖凝胶电泳检测提取的总RNA 是否存在降解和污染，通过紫外分光光度计Nanno-Photometer（LabTech，USA）检测提取的总RNA 的纯度。将符合要求的总RNA 送交北京贝瑞和康生物技术有限公司，其中每个组送2 个重复样品，构建的8 个cDNA 文库采用IlluminaHiseq-2500 平台进行转录组测序。对测序获得的原始数据进行数据整理分析，然后将获得的Clean Reads 采用HISAT（version 0.1.6）与草鱼基因组（草鱼基因组下载地址：https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genome）进行比对分析，再根据FPKM（Fragments per kilobase of transcript per million fragments mapped）方法计算各样本间基因的差异表达，随后根据差异表达基因进行基因功能注释及富集分析[6]。

1.2.3 荧光定量PCR分析为了验证MC-LR 对草鱼肝脏转录组测序结果的准确性，在差异基因数据库中随机挑选3 个基因，利用Primer 5.0 设计引物（表1），分析荧光定量PCR（qRT-PCR）结果是否与转录组测序结果一致。取转录组测序剩余的RNA 样品，其中对照组和实验组均有2个重复，采用RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit 试剂盒进行反转录合成cDNA。随后将cDNA 模板稀释10 倍保存于-20 ℃备用。荧光定量PCR 采用CFX96 Touch™Real-Time PCR Detection System，反应体系为：10 µL SYBR Green Real-time PCR Master Mix，2.0µL稀释的cDNA模板，上下游引物分别各0.5µL（20µmol/L），加ddH2O 补充至20 µL。反应程序为：95 ℃变性5 min；95 ℃10 s，58 ℃15 s，72 ℃20 s，40 个循环，72 ℃延伸5 min。每个样品的定量分析重复3 次，以GAPDH作为内参基因，采用2-ΔΔCt法计算相对表达量。

表1 荧光定量PCR引物Tab.1 Primers of quantitative real-time PCR

2 结果与分析

2.1 肝脏脂质代谢相关的KEGG通路

对照组和3 个MC-LR 实验组的clean reads 数据为4.1×107～5.6×107，与对照组相比，25，75，100µg/kg实验组的差异表达基因分别有953、4 729和2 265个，其中表达上调的基因分别有574、2 498和1 472个，表达下调的基因分别有379、2 231 和793 个，3 个MC-LR 实验组共同的上调表达基因有320 个，下调的有137 个[6]。

通过KEGG 分析发现，25µg/kg 实验组草鱼肝脏暴露96 h 后，DEGs 富集在12 条脂质代谢相关通路上，而在75µg/kg和100µg/kg实验组中，DEGs富集在15条脂质代谢通路上，与25µg/kg实验组脂质代谢通路相比，还富集了不饱和脂肪酸生物合成、脂肪酸延长和脂肪酸合成代谢3条脂质代谢通路（表2）。

表2 MC-LR对草鱼肝脏脂质代谢通路的影响Tab.2 The effects of MC-LR on the lipid metabolism of grass carp liver

2.2 脂质代谢通路中的DEGs

2.2.1 不同剂量MC-LR 对草鱼肝脏脂质代谢通路差异表达基因的影响根据表2 可知，25µg/kg 实验组草鱼肝脏中涉及到的脂质代谢通路上的DEGs 为37 个。其中脂肪酸合成通路、不饱和脂肪酸合成通路以及脂肪酸延长通路上均未富集DEGs。脂肪酸降解通路、初级胆汁酸合成通路和酮体的合成与降解通路均有1 个DEGs，醚脂类代谢通路、类固醇合成通路、亚油酸代谢通路和鞘脂类代谢通路中均有2 个DEGs，甘油酯代谢通路和花生四烯酸代谢通路中有5个DEGs，甾类激素生物合成通路有7个DEGs，甘油磷脂代谢通路则出现8个DEGs。

75µg/kg 实验组草鱼肝脏中脂质代谢DEGs 上升至363 个，其中脂肪酸合成代谢、不饱和脂肪酸合成通路、脂肪酸延长通路以及脂肪酸降解通路均富集了大量DEGs，这4 个通路上分别有10、23、21 和40 个DEGs。初级胆汁酸合成通路有19 个DEGs，甘油酯代谢通路有37 个DEGs，甾类激素生物合成通路有50 个DEGs，花生四烯酸代谢通路有35 个DEGs，甘油磷脂代谢通路有45 个DEGs，醚脂类代谢通路有16 个DEGs，类固醇合成通路有9 个DEGs，亚油酸代谢通路有14 个DEGs，鞘脂类代谢通路有28 个DEGs，酮体的合成与降解有5个DEGs。

100µg/kg实验组草鱼肝脏中脂质代谢相关基因有132个发生了显著变化，其中脂肪酸合成代谢、不饱和脂肪酸合成通路、脂肪酸延长通路以及脂肪酸降解通路分别有6、12、9和13个基因有显著变化。甘油磷脂代谢通路有19 个DEGs，甘油酯代谢通路和甾类激素生物合成通路均有14 个DEGs，鞘脂类代谢通路有12 个DEGs，花生四烯酸代谢通路和醚脂类代谢通路均有8 个DEGs，类固醇合成通路有7 个DEGs，初级胆汁酸合成通路有6个DEGs，而亚油酸代谢通路和酮体的合成与降解通路均只有1个DEGs。

2.2.2 不同剂量MC-LR暴露下草鱼肝脏共同的脂质代谢差异表达基因由表2可知，经不同剂量MC-LR处理后，有12 个基因在3 个实验组中表达同时上调（表3），有14 个基因在3 个剂量组中表达同时下调（表3）。其中表达上调的基因主要有：SMPD2、cPLA2、PTGES3、SQS、UGT5A4、GSH-Px和PTGS等。表达下调的基因主要有：MICAL3A、LIPC、LPL、BDH1、ETTNPL、UGT1A7、SOAT2、UGT1A7和CPT-1等。

表3 不同剂量MC-LR暴露下草鱼肝脏共同的脂质代谢差异表达基因Tab.3 The common DEGs of lipid metabolism from grass carp liver exposure to different doses of MC-LR

2.3 不同剂量MC-LR对草鱼肝脏PPAR信号通路和基因的影响

3 个剂量的MC-LR 对草鱼肝脏PPAR 信号通路均有影响，其中25µg/kg 实验组草鱼肝脏PPAR 信号通路涉及12 个基因有显著变化，其中表达显著上调的基因主要包括FABP1和FABP4，表达显著下调的基因主要包括FATP、PPARα、CYP7A1、LPL、ADIPO。而75 µg/kg 实验组中草鱼肝脏共有70 个基因有显著差异表达，表达显著上调的基因主要包括FABP1、FABP4、ILK和AQP7等9 个基因，表达显著下调的基因包括FATP、PPARα、SCD-1、CYP7A1、CYP8B1、CYP27、FATP1、LPL、CYP4A1、CPT-1和CPT-2等61 个基因。100 µg MC-LR/kg 实验组中草鱼肝脏则有31 个基因表达有显著变化，其中有FABP1、PGAR、FABP4、CAP和UBC6 个基因表达显著上调，FATP、PPARα、RXR、SCD-1、LPL、CYP7A1、CYP8B1、CYP27、CPT-1、CPT-2、LCAD和ACO等25个基因表达显著下降。3个剂量的MC-LR对草鱼肝脏PPAR信号通路上诱导的共同的DEGs 有8 个（表4），包括3 个上调的和5 个下调的表达基因，其中FABP4显著上调，在25、75 和100µg/kg 实验组的表达分别上调了3.39、41.07 和25.46 倍；FABP1分别上调了4.56、2.45 和2.19倍；PPARα在3个剂量组中分别下调了0.32、0.15和0.24倍，CYP7A1分别下调了0.47、0.18和0.35倍，LPL分别下调了0.42、0.27和0.46倍；其他3个表达有显著变化的为未知基因。

表4 不同剂量MC-LR暴露下草鱼肝脏PPAR信号通路上共同的差异表达基因Tab.4 The common DEGs of PPAR pathway from grass carp liver exposure to different dose of MC-LR

2.4 荧光定量PCR验证结果

为验证测序数据的准确性，随机选取的3个DEGs进行qRT-PCR 反应。结果显示这3个基因表达水平的趋势变化与转录组测序结果中的表达趋势基本一致，表明转录组测序结果可信。

图1 3个DEGs的荧光定量PCR及转录组的比较分析Fig.1 Comparison of three DEGs by quantitative real-time PCR and transcriptome analysis

3 讨论

3.1 MC-LR对草鱼肝脏脂质代谢通路和差异表达基因的影响

肝脏是一个高度活跃的代谢器官，在全身脂质代谢的各个方面起着关键作用[7]。目前，已有一些研究表明MCs 对小鼠肝脏脂质代谢有影响，并从基因表达水平、酶活水平、组织病理切片等方面进行了研究。如MC-LR 可导致小鼠脂质代谢相关基因（Angpt1和PPAR）在mRNA 和蛋白水平均发生改变，增加腹腔脂肪质量和体脂比，降低空腹血糖、血清中高密度脂蛋白以及甘油三酯含量[8]。韦宏旷等[9]通过检测分析MC-LR 对小鼠MDA 的影响，发现MC-LR 会对肝脏脂质代谢有影响。另外，MC-LR 也可通过改变血清中甘油三酯、不饱和脂肪酸和极低密度脂蛋白等代谢物的水平，从而造成小鼠肝脂质代谢紊乱，引起肝脏质量和腹部脂肪质量增加[5]。以上报道均表明MC-LR可影响哺乳动物的脂质代谢。

脂质是生物体内重要的一大类化合物，可分为脂肪酸、鞘脂类、糖脂和多聚酮类等八大类。这些脂质在生物体内发挥重要的生理功能。脂质稳态是由复杂的网络和反馈机制控制的，涉及机体的多个组织器官、转录因子、酶、激素和营养物质等，不同的信号通路之间存在复杂的交互作用[10-11]。脂质代谢受多个信号通路共同调控，包括脂肪酸合成代谢、不饱和脂肪酸合成通路、脂肪酸延长通路、脂肪酸降解通路、甘油磷脂代谢通路、甘油酯代谢通路、甾类激素生物合成通路、鞘脂类代谢通路、花生四烯酸代谢通路、醚脂类代谢通路等多个通路。本研究结果发现在低剂量组（25µg/kg 组）的草鱼肝脏中有12 条通路受到影响，而75µg/kg和100µg/kg实验组受到影响的通路均有15条。在低剂量组中，脂肪酸合成通路、不饱和脂肪酸合成通路以及脂肪酸延长通路没有受到影响，这说明MC-LR 对草鱼肝脏脂质代谢通路的影响存在一定的剂量差异。低剂量MC-LR 对草鱼肝脏脂质代谢影响较小，而高剂量对草鱼肝脏脂质代谢影响非常大，尤其是对脂肪酸降解信号通路有显著影响，这与其他人报道不太一致。李智等[12]经转录组测序分析发现凡纳滨对虾注射MC-LR后，主要引起鞘脂类代谢障碍，而谭智蓉等[13]通过转录组测序同样发现MC-LR主要对欧洲鳗鲡肝脏鞘脂类代谢有影响。尽管在笔者的研究中发现3个剂量组均可以导致鞘脂类代谢通路发生变化，但相对于其他通路来说，鞘脂类代谢通路在25，75，100µg/kg 实验组中受到影响的脂质代谢通路中均位列较后，这说明MC-LR 对草鱼肝脏的影响并不是以鞘脂类代谢为主。除此之外，甘油磷脂代谢通路也有受到影响，这与在斑马鱼中的报道相似[14]。花生四烯酸、亚油酸和α-linoleic酸在鱼体中也都起着非常重要的作用[15]，本研究也发现了MC-LR可以引起这些通路的变化，必需的和重要的脂肪酸代谢通路中的任何干扰都可能影响大量的细胞和生物过程，这或许可以解释MC-LR 可引起机体多方面毒性。以上研究说明这些代谢途径并不是独立工作的，而是相互联系的，因此MC-LR对草鱼脂质代谢的影响也是非常复杂多样的。

机体内脂质代谢与众多脂质代谢相关基因的表达密不可分。本研究的转录组测序结果显示25，75，100µg/kg 3个剂量组中的差异表达的脂质相关基因分别有37、363和132个，其中3个剂量组中共同差异表达的差异基因为27个。这也说明MC-LR对草鱼肝脏的脂质代谢存在明显影响。除了脂质运输外，肝脏中脂质含量也依赖于脂肪酸β-氧化及胆固醇代谢和运输[16]。其中，肉毒碱棕榈酰转移酶系统在长链脂肪酸的β-氧化过程中十分关键[17]。Peroxisomal acyl-CoA oxidase 1（acox1），acyl-CoA dehydrogenase（acadm）和线粒体膜carnitine-dependent enzyme shuttle（cpt1a，cpt2）是脂肪酸β-oxidation 的关键酶[18]。CPT-1 是肉碱棕榈酰转移酶系统的第一个成分和限速步骤[19]，转录组测序和荧光定量的结果均显示CPT-1在3个剂量组中的表达下降，说明MC-LR可降低长链脂肪酸的β-氧化，从而造成脂肪的沉积。另外，在本研究中，前列腺素的合成相关的基因PTGS2和PTGES3显著上调，这可能与必须脂肪酸的合成被干扰相关，这些脂肪酸是合成前列腺素的前体分子[14]。肝脏脂肪生成与脂肪分解的不平衡是引起脂肪代谢异常的重要原因之一[20]，而肝脏脂质代谢异常也是诱发肝癌的机制之一[21]，因此，MC-LR 易导致肝癌的发生的机制可能与脂质代谢也有关。

3.2 MC-LR对草鱼肝脏PPAR信号通路和差异表达基因的影响

PPAR 信号通路可以调控一系列与脂质代谢相关的基因和通路[22]，这一通路在细胞内脂肪酸代谢和脂质储存中起着重要作用[23]。不饱和脂肪酸的生物合成是PPAR 信号通路调控的下游途径之一[24]，在不饱和脂肪酸生物合成的过程中，长链脂酰辅酶A 在Acaa1a 和Scd1 作用下通过脱乙酰、去饱和和延长转化为多种未饱和脂肪酸，从而导致不饱和脂肪酸水平增加[25]。类固醇生物合成途径也受到PPAR 信号通路激活的干扰，从而导致与胆汁酸代谢相关的胆固醇、胆碱和牛磺酸水平降低[26-27]。胆汁酸是一类胆固醇类内分泌信号分子，在机体胆固醇吸收、代谢及调节中起着重要作用[28]。同时，胆汁酸可促进脂溶性营养物质的吸收和消化[29]，其合成过程中出现的任何损伤都会引起整个脂质代谢过程的紊乱[30]。

PPAR 信号通路可参与机体不同生理条件下的大量生化过程，其中包括炎症、癌症等多种复杂疾病的病理生理过程[5,31]。在本研究中，3个剂量组的差异表达基因均可富集到PPAR信号通路上。PPARα作为转录因子，它在肝脏脂质代谢中起着重要的调节作用[32-33]，PPARα 也被认为是众多调控脂分解代谢中最为关键的调控因子[34]，其可诱导脂肪酶分解基因的表达从而在脂肪酸的分解代谢方面起着重要的作用[35]。激活PPARα 可促进脂肪酸的吸收、利用以及脂肪酸的分解代谢[33]。笔者目前的研究显示PPARα在3 个剂量组中的表达均显著下降，PPARα 信号通路的其他下游基因如CYP7A1、LPL等表达也明显下调，这些结果说明MC-LR 可降低草鱼肝脏分解脂肪的能力从而影响脂质代谢，可能会加速脂肪的沉积。FABPs 属于细胞内蛋白家族，它可以可逆地与疏水性配体结合，包括饱和及不饱和脂肪酸等，在脂质代谢中发挥重要作用[36]。本研究发现FABP1和FABP4在3 个剂量组中都表达增加，尤其是FABP4表达最高上调了41.07倍。FABP4作为细胞内脂质伴侣，可影响吸收、运输、酯化和脂肪酸的β-氧化，调节能量平衡和细胞内脂质信号转导[37]，本研究中3个剂量组的FABP4均表达上调，这进一步表明MC-LR 可能引起草鱼肝脏代谢性障碍。