杨家磊，唐 朝，廖芮婷，加晓芳，何 涛，杨文理

0 引 言

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，已成为全球第一大癌症[1]。根据生物学行为、临床病理特征和分子特征的表达不同，乳腺癌可分为多种亚型。其中，三阴性乳腺癌(triple-negative breast cancer, TNBC)是一类雌激素受体(estrogen receptor, ER)、孕激素受体( progesterone receptor, PR)、和人表皮生长因子受体2( human epidermal growth factor receptor, HER-2)表达均为阴性的乳腺癌[2]。TNBC的恶性程度高、侵袭性强、复发转移率高、死亡率高。因此，寻找三阴性乳腺癌发生发展的相关基因，并阐明其可能的分子机制，对三阴性乳腺癌的防治具有重要意义。

转胶蛋白(transgelin, TAGLN)是钙调节蛋白家族成员之一，由单一N-末端钙蛋白同源结构域(CH)和C-末端钙调蛋白样模序(CLIK)组成[3]。TAGLN在除骨骼肌、红细胞和神经元外的所有细胞和组织中都表达，在平滑肌细胞和成纤维细胞中含量最高。TAGLN与肌动蛋白结合参与细胞骨架相关的细胞增殖、分化、上皮间质转换(epithelial-mesenchymal transition, EMT)等生命活动，与肿瘤的发生发展密切相关。研究表明，TAGLN在不同类型的癌症中的表达不同且作用是相互矛盾的，在乳腺癌[4]、结直肠癌[5]、食管鳞癌[6]和前列腺癌[7]中表达降低，而在晚期结直肠癌[8]、肺癌[9]、胃癌[10]和胰腺癌[11]中表达增强。肿瘤的发生发展是一个多因素、多基因参与的复杂过程，其中细胞凋亡及自噬在这一过程发挥着重要作用[12]。ERK1/2信号通路作为肿瘤研究中的经典信号通路在调节细胞增殖、迁移、凋亡和自噬等多种生物学功能中发挥重要作用[13]。

因此，本研究首先构建TAGLN慢病毒干扰质粒，用慢病毒感染三阴性乳腺癌细胞Hs578T，建立TAGLN敲低的Hs578T sh1、Hs578T sh2稳定细胞系和对照Hs578TCtrl稳定细胞系；然后，分析TAGLN对三阴性乳腺癌细胞凋亡、自噬的影响及作用机制，为三阴性乳腺癌的防治提供新的实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料三阴性乳腺癌细胞Hs578T、人胚肾HEK293T细胞、大肠杆菌DH5α感受态细胞、shRNA慢病毒质粒pLKO.1-puro为本实验室保存。抗体：TAGLN(Abcam,ab14106)购自成都万道生物科技发展公司，GAPDH(CST, 5174S)、ERK1/2(CST, 4695S)、p-ERK1/2(CST, 4370S)、PARP(CST, 9532S)，Caspase3(CST, 9662S)，Cleaved-Caspase3(CST, 9664S)，LC3A/B(CST, 12741S)购自优宁维生物科技有限公司，Bax(Proteintech, 50599-2-Ig)、Bcl-2(Proteintech, 12789-1-AP)、P62(Proteintech, 18420-1-AP)购自四川生工科技有限公司。DMEM(H)培养基(HyClone)、胎牛血清(FBS)(HyClone)购自成都金线科技有限公司，Western及IP细胞裂解液(凯基生物)购自成都豪乙科技有限公司，PrimeScriptTMRT reagent kit with gDNA Eraser(TaKaRa)购自成都微克生物技术有限公司。

1.2细胞培养Hs578T、HEK293T细胞用含10%FBS的DMEM(H)培养基培养，TAGLN敲低的稳定细胞系(Hs578T sh1、Hs578T sh2)及其对照稳定细胞系(Hs578T Ctrl)在培养时另加1 μg/mL Puromycin，所有细胞常规培养传代。

1.3靶向TAGLN基因shRNA慢病毒载体的构建与鉴定

1.3.1 靶向TAGLN基因shRNA的设计、合成和退火以TAGLN的mRNA序列 ( NM_001001522.2)为目标序列，根据shRNA设计原则，设计、合成2对靶向TAGLN的shRNA干扰序列见表1。靶向Luciferase的阴性对照质粒(ctrl)为实验室保存。将2对寡核苷酸单链片段分别溶于灭菌DEPC H2O，使其浓度为100 pmol/μL。将配对的寡核苷酸片段各取4 μL等量混合，加入8 μL10×M buffer(TaKaRa)，总体积16 μL。PCR仪上完成退火程序：96 ℃加热4 min，70 ℃加热10 min，缓慢冷却至4 ℃，-20 ℃保存。

表 1 靶向干扰TAGLN的shRNA序列

1.3.2靶向TAGLN基因shRNA质粒的构建和鉴定将退火后的寡核苷酸双链片段和AgeⅠ/EcoRⅠ酶切、纯化后的pLKO.1-puro shRNA表达质粒按摩尔比3～10:1，取pLKO.1-puro质粒 2 μL(55 ng)、退火寡核苷酸双链片段1 μL、ddH2O 2 μL、TakaRa ligation kit 2.1 solution(Ⅰ) 5 μL，总体积共10 μL。16 ℃连接过夜；再将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞；涂板、37℃倒置培养过夜；挑取单克隆培养，提取质粒并用AgeⅠ/EcoRⅠ酶切鉴定，体系为：质粒DNA 1 μg, 10×H buffer 2 μL,EcoRⅠ(12 Unit/μL) 0.5 μL，NdeⅠ(12 Unit/μL) 0.5μL加ddH2O 补足20 μL，37 ℃孵育2 h。经1g/L琼脂糖凝胶电泳酶切产物，阴性质粒仅有75 bp插入条带，阳性质粒可见134 bp插入条带，20%甘油保种。阳性克隆菌送生工生物工程(上海)股份有限公司测序，分别将测序正确的克隆命名为sh1和sh2。

1.4确定Hs578T细胞的Puromycin最佳筛选浓度接种2×105个/(0.5 mL·孔)的Hs578T细胞至24孔板，当细胞70%～80%融合时，分别加入不同浓度的嘌呤霉素浓度(0、0.5、1、2、4、6、8 μg/mL)；继续培养，每隔3天换液，7 d后，选择Hs578T细胞全部死亡的最低嘌呤霉素浓度(1 μg/mL)作为最佳筛选浓度。

1.5构建TAGLN沉默的Hs578T稳定细胞系大量提取测序正确的2种TAGLN shRNA质粒(sh1和sh2)和阴性对照质粒(ctrl)，待HEK293T细胞融合到70%～80%时进行慢病毒包装。根据Lenti-PacTMHIV慢病毒包装试剂盒(GeneCopoeia)说明书，分别制备质粒DNA-转染试剂复合物，更换细胞培养基为无血清无双抗的DMEM(H)；将复合物分别滴加入细胞培养基中，8 h后更换新鲜全培养基；再继续培养48 h，分别收集24 h和48 h的细胞培养基(含病毒颗粒)，0.45 μm的无菌滤器过滤去除细胞碎片，获得慢病毒悬液，-80 ℃保存备用。待Hs578T细胞融合到70%～80%时，换液，加8 μg/mL的Polybrene，用慢病毒悬液进行感染。24 h后，用 1 μg/mL 的Puromycin对细胞进行筛选，2～4周后获得TAGLN敲低的稳定细胞系(Hs578T sh1、Hs578T sh2以及对照稳定的细胞系(Hs578T Ctlr)。

1.6qRT-PCR和Western blot用Trizol分别提取稳定转染细胞的总RNA，并根据PrimeScriptTMRT reagent kit with gDNA Eraser说明书，去除基因组DNA后进行逆转录。qPCR引物见表2，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；qPCR体系为：TB Green Premix Ex TaqⅡ12.5 μL、PCR Forward Primer(10 mΜ) 1.0 μL、PCR Reverse Primer(10Μm)1.0 μL、RT反应液(cDNA溶液)2 μL、灭菌水、8.5 μL，总体积25 μL；qPCR反应条件为95 ℃ 30sec→95 ℃ 5sec→60 ℃30～60sec，后面两个步骤重复40个循环，采用2-△△CT法进行定量分析。

表 2 qPCR引物序列

按细胞总蛋白提取试剂盒(南京凯基)说明书，分别提取稳定转染细胞的总蛋白，留取小部分进行BCA(碧云天)浓度测定；其余总蛋白按比例加入5×上样缓冲液，沸水浴10 min变性，分装、-80 ℃保存备用；蛋白样品进行12% SDS-PAGE电泳，转膜，5%BSA-0.1%TBST封闭1h；分别加封闭液稀释的一抗TAGLN(1∶500)、GAPDH(CST，1∶1000)、ERK1/2(1∶1000)、p-ERK1/2(1∶1000)、Bax(1∶500)、Bcl2(1∶500)、Caspase3(1∶1000)、Cleaved-Caspase3(1∶500)、LC3I/II(1∶1000)、P62(1∶500)4 ℃、过夜孵育；1×TBST漂洗5 min×3次，室温孵育相应的近红外荧光二抗1 h，1×TBST漂洗5 min×3；Odessey近红外成像系统进行图像采集及灰度分析。

1.7流式细胞术检测细胞的凋亡分别收集TAGLN敲低的稳定细胞系Hs578T sh1、Hs578T sh2及对照稳定细胞系Hs578T Ctrl，各个细胞系分别分组：空白组(不加FITC-Annexin V、PI组)、FITC-Annexin V组(只加FITC-Annexin V)、PI组(只加PI组)、FITC-Annexin V+PI组(加FITC-Annexin V及PI)。按Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒(凯基生物)说明书，分别加入100 μL Binding Buffer重悬细胞；每组分别不加或加入5 μL FITC-Annexin V和(或)5 μL 50 μg/mL PI，室温避光孵育15～25 min，再加入400 μL的Binding Buffer终止染色，避光、1 h内完成流式细胞仪上机检测。

2 结 果

2.1 TAGLN敲低Hs578T稳定细胞系的构建及鉴定NdeⅠ/EcoRⅠ双酶切结果显示，获得插入TAGLN shRNA序列的阳性质粒，见图1。测序结果显示，成功建立了TAGLN慢病毒shRNA质粒(sh1及sh2)，见图2。包装慢病毒并感染Hs578T细胞，经1 μg/mL puromycin筛选2～4周后，获得TAGLN敲低的稳定细胞系(Hs578T sh1、Hs578T sh2)及对照细胞系(Hs578T Ctrl)。Western blot和qPCR结果显示，与对照细胞Hs578T Ctrl相比，TAGLN敲低细胞Hs578T sh1、Hs578T sh2的TAGLN蛋白表达分别减少58%、21%(P<0.01)、mRNA表达分别降低32%、48%(P<0.01)，见图3。提示TAGLN敲低的三阴性乳腺癌稳定细胞系Hs578T sh1、Hs578T sh2及其对照稳定细胞系Hs578T Ctrl构建成功。

2.2敲低TAGLN促进Hs578T细胞的凋亡流式细胞术检测细胞凋亡结果显示，敲低TAGLN的三阴性乳癌Hs578T sh1、Hs578T sh2稳定细胞较Hs578T Ctrl细胞的总凋亡率分别增加100.7%、74.4%(P<0.01)，早期凋亡率分别增加126.4%、85.7%(P<0.01)，晚期凋亡率分别增加49.2%、51.9%，见图4，表3。Western blot结果显示，敲低TAGLN的Hs578T sh1、Hs578T sh2稳定细胞较Hs578T Ctrl细胞的抗凋亡蛋白Bcl-2表达均减少，促凋亡蛋白Bax表达均增多，Bax/Bcl-2的分别增加148%、115%，Cleaved-PARP蛋白分别增加41%、34%，Capase3蛋白分别增加26%、11%，Cleaved-Caspase3 蛋白增加27%、21%(P<0.01)，见图5。表明敲低TAGLN促进了三阴性乳腺癌Hs578T细胞的凋亡。

2.3敲低TAGLN抑制Hs578T细胞的自噬通量Western blot结果显示，敲低TAGLN的Hs578T sh1、Hs578T sh2稳定细胞较对照Hs578T Ctrl细胞的LC3-Ⅱ蛋白表达减少，而P62蛋白表达升高(P<0.01)，说明敲低TAGLN抑制了三阴性乳腺癌Hs578T细胞的自噬通量。见图6。

1、3、5: 分别是ctrl、 sh1、 sh2未进行酶切; 2、4、6: 分别是酶切后的ctrl、sh1、 sh2

a：TAGLN sh1质粒的测序结果；b: TAGLN sh2质粒的测序结果

*P<0.01、**P<0.001

图 4 敲低TAGLN增加Hs578T细胞的凋亡率

表 3 Hs578T Ctrl、Hs578T sh1、Hs578T sh2细胞的凋亡率比较

*P<0.01、**P<0.001

*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001

2.4敲低TAGLN通过ERK1/2信号通路影响Hs578T细胞的凋亡和自噬Western blot结果显示，敲低TAGLN的Hs578T sh1、Hs578T sh2稳定细胞较对照组Hs578T Ctrl细胞的ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表达减少(P<0.01)，提示敲低TAGLN可能通过抑制ERK1/2的磷酸化水平，进而促进三阴性乳腺癌细胞的凋亡及抑制细胞的自噬通量。见图7。

*P<0.01、**P<0.001

3 讨 论

TAGLN是一种细胞骨架相关蛋白，该基因及其蛋白质序列具有种属间的高度同源性及进化保守性。TAGLN主要通过稳定肌动蛋白丝，参与细胞骨架的重塑，进而参与肿瘤的发生发展，但在不同类型肿瘤中的生物学功能又不尽相同甚至相反的。既往研究报道TAGLN基因的缺失对肿瘤早期进展很重要，可作为乳腺癌和结直肠癌的诊断标记物之一；可促进乳腺癌血管正常化并抑制血管出芽和肿瘤转移；过表达TAGLN抑制人乳腺癌细胞系MDA-MB-231的体外迁移和侵袭；TAGLN启动子甲基化下调其表达并与乳腺癌患者无复发生存率呈负相关[4，14-16]。本研究通过慢病毒shRNA沉默TAGLN，建立TAGLN敲低的Hs578T sh1、Hs578T sh2稳定细胞系和对照Hs578T Ctrl稳定细胞系，探讨敲低TAGLN是否影响三阴性乳腺癌Hs578T细胞凋亡及自噬。

细胞凋亡是由多种基因调控的细胞程序性死亡，主要有线粒体途径、死亡受体途径、内质网途径及颗粒酶B途径[17]。在线粒体途径中，Bcl-2家族是最为重要的调节因子之一，包含促凋亡因子(Bax, Bad, Bid)和抗凋亡因子(Bcl-2, Bcl-W, Mcl-1)两类。Bcl-2和Bax形成异源二聚体调节转录活性，通过细胞色素C的释放调节细胞凋亡，Caspase-3在凋亡级联反应的下游发挥重要作用，通过降解细胞内相应底物诱导细胞发生凋亡[18]。本研究中流式细胞术结果显示，与对照Hs578T Ctrl稳定细胞系相比，敲低TAGLN的Hs578T sh1、Hs578T sh2稳定细胞系的凋亡率增加，Bcl-2表达下调，Bax、Cleaved-PARP、Caspase3、Cleaved-Caspase3表达上调，提示敲低TAGLN通过激活Caspase3从而促进了三阴性乳腺癌细胞Hs578T的凋亡。

自噬是一种保守的分解代谢过程，在维持细胞内环境稳态、物质循环再利用等方面发挥重要作用[19]。自噬发生过程中涉及一系列信号转导途径的参与，在机体营养不充足时，mTOR失活、MAPK活化催化ULK1复合物的形成，从而引发自噬[20]。自噬发生后，LC3-Ⅰ在共价连接酶ATG3的作用下转变为膜结合形式的LC3-Ⅱ，参与自噬小体的结合；P62是一种泛素结合的蛋白，在自噬发生时P62可与LC3-Ⅱ蛋白结合形成复合物，然后在自噬溶酶体中降解[21-22]。本研究中，TAGLN敲低Hs578T sh1、Hs578T sh2稳定细胞系中LC3-Ⅱ的表达减少，P62表达增加，表明敲低TAGLN通过减少LC3-Ⅱ而抑制了Hs578T细胞的自噬通量。

丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPK)是细胞内的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，参与细胞生长、分化和程序性死亡等一系列生物学过程。在哺乳动物细胞中，与ERK1/2相关的细胞内信号途径被认为是经典MAPK信号转导途径；ERK1/2参与多种生物学调节过程，包括细胞周期、迁移、凋亡及自噬等。研究表明ERK1/2通过下调Bcl-2、MMP-9等蛋白，上调Bax、Bad等蛋白促进细胞凋亡，而TAGLN过表达导致RAS和ERK1/2的激活增加，其下调也导致激活的RAS和ERK1/2减少[23-24]。在HeLa细胞中，氧化应激诱导剂VK3诱导细胞自噬，激活ERK1/2，ERK1/2抑制剂U0126可以阻断该过程LC3-Ⅱ的表达，说明ERK1/2参与细胞自噬的形成[25]。在本研究中，敲低TAGLN的Hs578T sh1、Hs578T sh2稳定细胞系的ERK1/2、p-ERK1/2明显下调，说明TAGLN以依赖ERK1/2途径促进三阴性乳腺癌细胞Hs578T的凋亡及抑制自噬通量。

综上所述，本研究成功构建了TAGLN低表达及对照的三阴性乳腺癌Hs578T稳定细胞系，TAGLN沉默促进三阴性乳腺癌细胞凋亡并抑制自噬通量，说明TAGLN在三阴性乳腺癌Hs578T细胞中扮演癌基因的角色，可能促进肿瘤的发生发展，为深入研究TAGLN作为三阴性乳腺癌防治的潜在分子靶点提供了实验依据。