韦丽虹，肖云峰，何玉林，赵振峰，张国建

(1. 内蒙古自治区国际蒙医院药学部，内蒙古 呼和浩特 0100651； 2. 内蒙古医科大学药学院，内蒙古 呼和浩特 010100； 3. 内蒙古医科大学附属医院核医学科，内蒙古 呼和浩特 010050)

在临床实践中对急性心肌梗死和不稳定心绞痛患者的最有效、最直接的治疗方法是及时行经皮冠状动脉介入治疗或冠状动脉搭桥术使病变血管再通，早期有效实现心肌血流再灌注，限制心肌梗塞面积扩大、防止左心室重塑，保证左心室收缩功能[1]，但心肌恢复血流灌注之后会带来再灌注损伤的发生，可出现微血管损伤、心功能障碍、心律失常等改变，使心肌损伤进一步加重,即产生心肌缺血-再灌注损伤(Myocardial Ischemia-Reperfusion Injury，MIRI)现象。

MIRI是心血管医生面临的巨大挑战，一直是心血管疾病治疗特别是心脏介入及心脏外科领域研究的热点。关于MIRI发病机制的研究尚未完全阐明，大多数研究认为与心肌细胞能量代谢障碍、超微结构损伤、细胞内Ca2+超载、氧自由基损伤、白细胞的激活、粒细胞浸润以及心肌细胞的凋亡等作用有关[2-6]。

有研究发现[7],心肌能量代谢障碍是MIRI的起始。心脏是生物体非常重要的器官，具有高耗氧、高耗能、高功能的特点，其本身的能量储备很少，一旦发生缺血缺氧，心肌细胞的能量代谢方式迅速发生变化，ATP生成急剧减少，出现能量代谢障碍，使细胞的能量供给减少。研究认为[8]，心肌的能量代谢出现了障碍之后，心肌细胞基因的表达将会产生变化，ATP的水平可明显影响着细胞坏死以及凋亡的产生。因此，对MIRI心肌能量代谢功能进行深入研究具有重要意义。

18F-FDG是核医学检查中广泛应用的一种葡萄糖代谢类显像剂，基于心肌对于葡萄糖的利用规律与特点，应用18F-FDG可在体外用核医学设备PET/CT显像，观察葡萄糖在正常心肌与异常的心肌内的代谢分布情况，真实反映心肌正常、缺血和坏死等情况，在临床上可以很好的针对有功能障碍心肌活力进行检测[9]。本研究应用18F-FDG小动物 PET/CT显像对SD大鼠MIRI葡萄糖能量代谢功能进行观察，旨在探讨MIRI的能量代谢功能障碍机制及变化规律。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Innovation Drive MM型Micro PET/CT(德国SIEMENS公司)；Minitrace型回旋加速器(美国GE公司)；Matrx VMR型麻醉机(美国MA-TRX公司)；V-100小动物呼吸机(上海玉研科学仪器有限公司)；ECG-3A型数字心电图机(深圳市埃顿实业有限公司)；2.5%异氟烷(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)；3%戊巴比妥钠(北京华业寰宇化工有限公司)

1.2 实验动物与分组

健康雄性SD大鼠，清洁级，8月龄，体重285±50g，购置于内蒙古医科大学动物实验中心，实验动物生产许可证号：SCXK(蒙)2016-0001。该实验方案经内蒙古医科大学伦理委员会批准，伦理审批文件编号(NO): YKD2017092。根据结扎大鼠冠状动脉时间不同分为轻度缺血组(结扎10秒)、中度缺血组(结扎30秒)及重度度缺血组(结扎60秒)，每组SD大鼠20只。

1.3 MIRI模型制作

腹腔注射 3%戊巴比妥钠 1mL·kg-1麻醉，仰卧位固定大鼠，经口腔行气管插管，胸部去毛，75%酒精擦拭胸部皮肤消毒，于左锁骨中线与左侧第3～5肋间心脏搏动最强点开胸，暴露心脏，结扎冠状动脉左前降支，根据实验组别结扎10秒、30秒、60秒，心电图检测中的T波改变、心肌颜色由红变浅，证实为心肌缺血造模成功，松解结扎线使血流再通，关闭胸腔，逐层缝合。所有模型鼠造模前、后各时段均记录心电图改变。

1.4 18F-FDG心肌显像

所用显像剂18F-FDG由内蒙古医科大学附属医院自行制备，放射性化学纯度均>98%，其他指标符合药典要求。

SD模型大鼠自由饮食，将模型大鼠放置麻醉舱内，2.5%的异氟烷(V/V，异氟烷：氧气)麻醉，成功后将模型鼠置于Micro PET/CT检查床，俯卧位固定，再用3.5%异氟烷(V/V，异氟烷：氧气)进行麻醉保持，注射18F-FDG 0.8mci，注射体积为0.2mL，详细记录分药时间、注射时间，测定注射前及注射后残余剂量。注射40～60分钟后，行Micro-PET/CT扫描，先采集CT图像，然后采集PET图像，CT图像采集条件：电压 85KV，电350 uA；扫描层厚0.06 mm，PET采集10分钟，采集视野FOV=12.7 cm，图像经衰减校正处理，应用Feldkamp方法重建。

1.5 心肌病理结构观察

所有显像完成后模型鼠全部处死，对心脏组织进行常规HE染色进行心肌病理学观察。离体心脏用固定液冲洗，将左心室前壁心肌组织切成条状，放在固定液中2h，接着用0.09 mmol KH2PO4漂洗15min，并在此溶液中保存。依次常规酒精逐级脱水、二甲苯透明、常规石蜡包埋，间断均匀切片，做HE染色，光镜下观察心肌病理结构改变。正常心肌染色均匀纤维完整，结构清晰，无水肿，无炎性浸润。缺血受损心肌则表现染色不均，肌原纤维显示欠清，嗜酸性增强。

1.6 数据处理及图像判读

通过SIEMENS Inveon MM工作站分别获得CT和PET以及二者融合的图像，由两位高级职称核医学医师盲法独立阅片。

所有图像都使用旋转电影三维显示方法(3D)进行分析。调整视窗的设置以获得最佳的心脏显示图像。视觉分析方法判断影像是否异常，判断标准是连续两个以上层面且其它体位相应的层面存在放射性分布稀疏或缺损判断为阳性结果。同时在受损心肌的边缘周围手工绘制三维感兴趣区域，并记录受损心肌每一层面的感兴趣区(ROI)平均值及SUVmean(平均感兴趣区域的放射性活度/每克体重的放射性示踪剂注入活度)，最后计算出心肌受损的体积(VOI)与SUVmean。意见不一致时相互讨论决定。

1.7 统计分析

应用SPSS 22.0软件进行数据统计分析，检验水准取α=0.05。所有测得数据资料均采用Mean±SD表示，显像剂各时间点受损心肌的SUVmean动态变化及受损心肌体积变化比较采用单因素方差分析，以P<0.05表示有差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 MIRI模型建立

SD大鼠实验过程中9只在造模过程中死亡，造模前麻醉意外死亡3只，显像过程中麻醉死亡2只，开胸结扎冠脉出现急性心衰死亡4，最终60只大鼠完成造模并显像，建模后心电图显示Ⅱ导联ST段改变大于0.2mv、 Micro PET/CT显像左心室壁18F-FDG摄取异常定义为模型建立成功(图1～2)。

2.2 心肌组织病理学检测

正常大鼠心肌细胞结构完整，肌纤维排列整齐，细胞核形态正常，心肌细胞无水肿。模型大鼠(重度缺血组)心肌结构损坏，肌纤维排列紊乱、肿胀断裂，细胞核有固缩现象，并伴有炎症细胞浸润(图3)。

2.3 不同程度缺血-再灌注后18F-FDG心肌显像动态观察

大鼠心肌轻、中、重度缺血再灌注后24小时和48小时18F-FDG显像，各组可见不同程度显像剂摄取稀疏-缺损区，72小时显像时，轻度缺血组受损心肌恢复，中度缺血组基本恢复，而重度缺血组有部分受损心肌恢复，仍有部分受损心肌未恢复(图6)，定量分析可见轻度缺血组受损心肌体积逐渐减小，72小时消失(F=136.58，P<0.05)，中度缺血组受损心肌体积逐渐减小，72小时仍有少部分受损心肌(F=121.42，P<0.05)，重度缺血组受损心肌体积逐渐减小，72小时仍有部分受损心肌存在(F=61.53，P<0.05)(图4～5，表1)

表1 不同组别大鼠心肌受损体积(mm3)比较(n=60)

2.4 不同程度缺血-再灌注后受损心肌SUVmean变化

大鼠心肌不同程度缺血再灌注后受损心肌SUVmean随时间延长逐渐增高，代谢逐渐恢复(F=415.39，P<0.05；436.47，P<0.05；361.42，P<0.05)，而24小时各组SUVmean存在统计学差异(F=30.62,P>0.05)，48小时各组SUVmean无统计学差异(F=10.62,P>0.05)，72小时各组SUVmean无统计学差异(F=2.17，P>0.05)(表2，图6)。

图1 A 正常SD大鼠心电图；B SD大鼠MIRI模型心电图，Ⅱ导ST段压低0.2mv以上，红色箭头所示

图2 A 正常心肌代谢显像，心室各室壁18F-FDG摄取均匀；B MIRI模型代谢显像，左心室心尖部18F-FDG摄取稀疏(阳性)(红色箭头所)。

图4 A 24小时显像，B 48小时显像，C 72小时显像

图5 不同组别各时间点受损心肌体积变化情况

表2 不同组别大鼠心肌SUVmean动态变化比较(n=60)

图6 不同组别各时间点受损心肌SUVmean变化情况

3 讨论

目前认为MIRI发生的基础是心肌能量代谢功能发生障碍[7]，因此可以通过能量代谢显像评价MIRI的发生、损伤程度、范围等。当心肌缺血时心脏功能及心肌细胞会发生一系列的变化，包括心肌血流灌注减低，能量代谢减低及室壁运动异常等。心肌血流灌注减低是其它异常发生的基础，短时间内血流可以恢复，但是代谢减低则恢复较慢，将持续较长时间。这种机制是心肌自我保护的过程。这样，心肌就可以适应较长时间的缺血状态。

有学者研究发现[10]，当心肌的能量代谢发生障碍，可导致心肌细胞的基因表达异常，ATP水平下降，使细胞膜上钠钙交换蛋白的活性下降，产生钙内流的增加，产生细胞内钙超载，同时促进氧自由基的堆积，大量的氧自由基进一步导致心肌受损。

我们的研究通过对轻、中、重度MIRI大鼠模型进行研究，在不同时间节点动态观察心肌葡萄糖代谢的变化规律。结果发现，不同程度的心肌缺血随灌注时间延长，心肌葡萄糖代谢损伤范围逐渐减小，程度逐渐减轻，SUVmean随时间延长逐渐增高，对于轻、中度心肌缺血，再灌注后葡萄糖代谢障碍可持续到48小时，重度者则持续72小时以上。SUVmean逐渐升高原因是18F-FDG在心肌细胞内摄取随时间延长逐渐增高，即心肌的能量代谢障碍逐渐减轻。三组的SUVmean在初期的24小时有明显差别，而在之后48小时及72小时差别逐渐减小。

正常情况心脏的主要能量代谢底物主要包括葡萄糖、乳酸、脂肪酸，当心肌氧充足供应时，以脂肪酸作为主要代谢底物，当糖摄入量增时，脂肪细胞释放游离脂肪酸减少，心肌则转变为以葡萄糖代谢为主。对缺血心肌而言，葡萄糖代谢会上调，而脂肪酸代谢则下降。因而对于缺血心肌能量代谢起关键作用的是葡萄糖，脂肪酸决定非缺血性心肌的能量代谢调节。18F-FDG是葡萄糖类似物，因此心肌摄取18F-FDG与血液中葡萄糖代谢底物水平密切相关。饮食状态会影响血液中葡萄糖及胰岛素浓度，进而使心肌摄取18F-FDG产生变化。因此，会根据不同目的需要，在显像准备前有针对性的将饮食状态进行调整[11-12]。

特别说明的是，本研究应用饮食状态下的大鼠进行的相关研究。以往的文献报道多是研究空腹状态下心肌18F-FDG摄取[13-15]，认为患者禁食状态下心肌缺血使葡萄糖摄取提高，正常心肌18F-FDG也有不同程度摄取增高。因此易与缺血心肌混淆。本实验开始之前进行了饮食与空腹两种状态18F-FDG代谢显像对比研究，研究结果提示饮食状态下18F-FDG心肌显像和空腹状态下心肌受损范围相似，因而可以应用饮食状态替代经典空腹状态18F-FDG PET/CT显像检测心肌缺血。

此外，以往的文献报道认为冠状动脉阻断持续时间≥15min后人类和犬缺血再灌注后区域性心肌血流量减少[16]，但对于大鼠急性心肌缺血模型阻断冠状动脉血流持续时间的报道说法不一或相关针对性的研究较少，本课题组经过探索，确定本实验大鼠重度心肌缺血时间窗为结扎冠状动脉60秒。与其他相关报道有一些差别，今后研究中我们将进一步摸索求证。

本研究为临床提供了一种能够在活体上评价MIRI的无创性影像学方法，也证实了不同程度MIRI的恢复有不同的时间窗，对于临床医生治疗决策的制定具有指导意义。

利益冲突 本研究由署名作者独立开展，不涉及任何利益冲突。