马 蓉，陈书强，雷 辉，金 妮，王晓红

空军军医大学唐都医院 妇产科生殖医学中心，陕西西安 710038

辅助生殖技术(assisted reproductive technology，ART)是现代医学的重要组成部分，近10年得到了充分的发展和应用，以体外受精为基础的辅助生殖技术已经成为治疗不孕症的主要手段。通过ART 出生的婴儿数量在世界范围内稳步增长，到目前为止已经超过800 万[1]。辅助生殖技术存在多种不良的妊娠结局，包括胎盘和胎儿生长方面[2]。因此，对ART 中的每一种干预措施均应进行单独研究。我们知道，自然妊娠每个月经周期中有1个优势卵泡发育成熟，而在辅助生殖技术操作中，利用控制性超促排卵(controlled ovarian hyperstimulation，COH) 这一关键步骤，通过注射超生理浓度的促性腺激素(卵泡刺激素和黄体生成素)，以覆盖体内自然内分泌调节系统，使多个卵子同时成熟，进而获得多个胚胎，增加妊娠成功的概率。研究显示，COH 导致母体子宫内膜微环境显著变化，且持续在着床期和胎盘早期。那么，COH 导致的异常母体子宫内膜微环境会对胚胎发育产生怎样的影响呢？本研究中，我们利用小鼠模型，消除了COH 对卵母细胞、体外受精和体外胚胎培养等的影响[3]，将未暴露于促性腺激素的体内受精囊胚移植入自然交配和超促排卵后的假孕雌鼠体内，单独研究COH 这一关键操作步骤对小鼠胎盘功能基因表达及胎鼠体重的影响。

材料与方法

1 实验动物 SPF 级8～ 10 周龄健康雌性ICR 小鼠70 只，体质量28～ 32 g；8～ 10 周龄雄性小鼠30 只，体质量34～ 40 g。购于北京华阜康生物科技公司。

2 主要试剂与仪器 马绒毛膜促性腺激素(Pro Spec)，人绒毛膜促性腺激素(Millipore)，溶于PBS 缓冲液；MⅡ胚胎操作液(Millipore)；反转录试剂盒(Taraka)，荧光定量试剂盒(Taraka)；RIPA 中蛋白裂解液(碧云天)，BCA 定量试剂盒(Thermo)，Luminex 液相悬浮芯片检测试剂盒(R&D Systems)，悬液微珠芯片平台Bio-Plex MAGPIX System(上海华盈生物医药科技有限公司)。

3 小鼠胚胎移植动物模型的建立 取12 只正常雄性小鼠，麻醉后，轻压腹腔，剪去腹部被毛，消毒后以腹部横切法剪开腹壁，用眼科镊斜向下方夹住一侧脂肪垫将睾丸、附睾和输精管拉出切口，钝性分离输精管，将其烧烙掉1 cm 左右，夹住脂肪垫将睾丸放入腹腔，同样方法处理另一侧，缝合手术切口。术后1 周，将自然发情雌性小鼠与其1∶1 合笼，次日上午8:00 检查雌鼠，见阴道栓者记为假孕0.5 d 并于妊娠5.5 d 解剖子宫，检查是否有胚胎植入，以确定雄鼠结扎成功。取3 只性成熟自然发情雌鼠作为自然交配代孕组(NC 组)，取3 只性成熟雌鼠腹腔注射马绒毛膜促性腺激素(5 IU/只)，48 h 后腹腔注射人绒毛膜促性腺激素(5 IU/只)，作为超促排交配代孕组(COH 组)，两组雌鼠与输精管结扎雄性小鼠1∶1 合笼，次日上午8:00 检查雌鼠，见阴道栓者记为假孕雌鼠妊娠0.5 d。取18 只性成熟自然发情雌鼠与18 只正常雄鼠1∶1 合笼，次日上午8:00检查雌鼠，见阴道栓者记为供胚雌鼠妊娠0.5 d，于妊娠3.5 d 显微镜下使用MⅡ培养液从子宫内冲出囊胚，后移入NC 组代孕鼠及COH 组代孕鼠子宫角，每侧各移植8 枚。每次移植实验建立移植模型6 只(NC 组3 只，COH 组3 只)，共进行3 次移植实验，NC 组和COH 组移植后顺利妊娠的雌鼠各8 只，于妊娠18.5 d 收取样本。

4 胎鼠及胎盘称重 NC 组与COH 组小鼠于妊娠18.5 d 解剖子宫，取胎鼠及胎盘称重并记录。

5 Real-time PCR RT-PCR 检测胎盘生长相关印记基因Igf-2、Peg3、H19、Mest、Cdkn1c、Mash2、Cd81、Plagl1、Zim1 和Ube3a 的mRNA 表达。取妊娠18.5 d 胎盘组织，采用Trizol 法提取两组胎盘样本中的总RNA，用Takara 反转录试剂盒(Cat#RR820，Lot#AKE1145A) 进行扩增，按照产品说明书进行操作。扩增程序：37℃，15 min；85℃，5 s；4℃，∞。Real-time 反应体系：2×TB Green Premix，12.5 μL；上游引物(10 μmol/L)，1 μL；下游引物(10 μmol/L)，1 μL；模板，2 μL，加入灭菌蒸馏水至25 μL。反应体系以GAPDH 为内参，引物序列见表1。

表1 Real-time PCR 引物Tab.1 Primers used for real-time PCR

6 Luminex 液相悬浮芯片技术检测胎盘生长相关细 胞 因 子VEGF、PIGF-2、PDGF-BB、MMP-2、MMP-9 和VEGFR2 的蛋白表达 胎盘组织样本蛋白抽提(RIPA 中裂解液)，BCA 法蛋白定量(Thermo)，取200 μg 等质量上样检测，经过样品孵育、检测抗体、显色等步骤，送入已校正的Bio-Plex 机器中读值。根据标准品得到的荧光检测值，使用多参数模式对标准曲线进行拟合，得到标准曲线及其方程，浓度单位为pg/mL。

7 统计学方法 采用SPSS22.0 统计分析软件对数据进行录入及分析。计量资料以表示，两组间比较采用t检验；P＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1 两组小鼠子代体质量、胎盘重量、胎盘效率比较 COH 组小鼠子代体质量、胎盘重量明显低于NC 组(P＜0.05)；COH 组小鼠胎盘效率(胎儿体质量/胎盘重量)明显低于NC 组(P＜0.05)。见表2。

表2 两组小鼠出生体质量、胎盘重量、胎盘效率比较Tab.2 Comparison of birth weight,placental weight and placental efficiency between the two groups

2 两组小鼠胎盘生长相关印记基因表达水平比较 与NC 组相比，COH 组小鼠胎盘印记基因Igf-2、Peg3、H19、Mest、Cdkn1c、Mash2、Cd81、Plagl1、Zim1、Ube3a 表达水平显著降低，差异均有统计学意义(P＜0.05)。见表3。

表3 Real-time PCR 检测两组小鼠胎盘mRNA表达水平比较Tab.3 Comparison of mRNA expression of placental tissue in mice by real-time PCR

3 两组小鼠胎盘生长相关细胞因子比较 与NC 组相比，COH 组小鼠胎盘VEGF、PIGF-2、PDGF-BB、MMP-2、MMP-9、VEGFR2 表达水平降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。见表4。

表4 Luminex 液相悬浮芯片技术检测两组小鼠胎盘生长相关细胞因子蛋白表达水平比较Tab.4 Comparison of protein expression of placental tissue in mice by Luminex liquid suspension chip technology

讨 论

研究表明，辅助生殖技术受孕分娩的新生儿低出生体质量的发生风险是自然受孕分娩新生儿的3 倍[4]。低出生体质量儿的患病率和死亡率较正常体质量新生儿显著升高，并且低出生体质量儿成年后患慢性疾病的风险也显著增加[5]。所以解析辅助生殖技术过程中导致试管婴儿低出生体质量的风险因素，对临床防治ART 低出生体质量儿的发生至关重要。我们知道新鲜周期移植是在超排卵后直接将新鲜胚胎移植到高剂量外源性激素刺激的子宫中，而在冷冻周期中，胚胎则被移植到更类似于自然周期的子宫环境中。研究表明，与冷冻周期相比，新鲜周期新生儿低出生体质量的风险显著升高[6]。这提示我们，COH 可能对子宫内膜容受性、胚胎发育等产生多方面的影响。我们的研究通过建立小鼠模型，消除了COH 对卵母细胞、体外受精和体外胚胎培养等的影响[3]，将未暴露于促性腺激素的体内受精囊胚移植入自然交配或超促排卵后的假孕雌鼠体内，单独研究COH 这一关键步骤对小鼠子代体质量及胎盘的影响，通过对胎盘印记基因、胎盘生长相关细胞因子的检测发现，COH 影响胎盘印记基因和胎盘生长相关细胞因子的表达。

印记基因在胎儿、胎盘的生长发育及胎儿出生后的生长等方面发挥着重要调节作用，大部分印记基因在胎盘组织高表达[7]，且研究发现印记基因可以通过控制胎盘中氨基酸、葡萄糖的转运调节母体与子代之间的营养物质传输，参与调控胎盘、胚胎之间的营养物质供需平衡[8]。研究表明，H19、Igf-2 和Cdkn1c 基因被印记并参与调节胎儿和胎盘的生长[9-11]。Mest 基因参与胎儿生长发育，敲除Mest 基因后出现胚胎和胎盘发育迟缓，且具有调节哺乳动物行为的功能[12]。本研究通过对这些重要印记基因的检测，发现控制性超促排卵可能降低小鼠胎盘生长相关印记基因的表达，进而影响子代的生长发育潜能。

胎儿的发育是由胎盘支撑的，胎盘是胎儿与母亲之间的界面，所有到达胎儿的营养和氧气都必须通过这个器官，胎盘可以协调母体对怀孕的适应并调动资源供胎儿使用[13]。既往研究发现，血管生成因子VEGF、PIGF 等在正常胎盘发育过程中参与血管重构，保证了母胎界面丰富的血流及胎盘的顺利形成[14-16]。PDGF 主要由单核巨噬细胞产生，其启动一系列细胞内信号转导，PDGFBB/PDGF-Rβ 相互作用在血管成熟中起关键作用[17]。MMPs 参与胚胎发育、伤口愈合、炎症细胞迁移、动脉粥样硬化及肿瘤浸润转移等多种生理和病理过程。研究发现，MMP-2 和MMP-9 在发情、月经周期和妊娠期间的子宫内膜组织重塑中发挥作用，在妊娠大鼠的主动脉和子宫中MMP-2和MMP-9 表达上调[18]。本研究中，我们采用Luminex 液相悬浮芯片技术对小鼠胎盘中胎盘生长及血管发生相关细胞因子进行了检测，结果表明控制性超促排卵导致小鼠胎盘生长及血管发生相关细胞因子表达水平降低。妊娠时蜕膜NK 细胞的主要功能是分泌VEGF、PIGF 等血管生成相关的细胞因子[19-20]。根据本课题组前期的研究，控制性超促排卵可以减少妊娠时蜕膜NK 细胞的数量，可能是导致上述结果的重要原因，有待进一步验证。

综上，我们利用小鼠模型发现，控制性超促排卵致小鼠子代体质量降低，胎盘重量降低，胎盘效率降低，但控制性超促排卵导致子代低体质量的具体分子和细胞机制仍有待阐明。临床中控制性超促排卵是否通过影响胎盘重量及效率而影响试管婴儿出生体质量，有待进一步揭示。