陈思杰，杜 娟，张 涛，顾沛雯

（宁夏大学 农学院，宁夏 银川 750021）

枸杞（Lycium barbarum）为茄科枸杞属落叶灌木，是我国传统常用的中药材之一。枸杞全身是宝，其果、叶、根、花均具有较高的药用价值和保健效果。宁夏、甘肃、青海、新疆等地是枸杞的主要产区，其中以宁夏种植面积最大，占全国种植面积的1/3[1]。在所有枸杞产区中以宁夏枸杞药用价值最高，为道地产区[2]。在中国等一些亚洲国家，枸杞的种植和使用已有2000多年历史[3]。枸杞根腐病是宁夏枸杞常发病害，特别是随着枸杞种植年限的延长，发病率逐年加重。一般年份发病率为15%左右，严重时发病率最高达50%以上[4]，甚至造成死树现象。给宁夏枸杞生产造成严重损失，已成为严重制约枸杞产业发展的瓶颈问题。

造成枸杞根腐病的主要病因是病原真菌侵染。据国内相关报道认为枸杞根腐病病原菌主要有尖孢镰刀菌（Fusariumoxysp orum）[5]、锐顶镰刀菌（Fusarium acuminatum）、串珠镰刀菌（Fusariu mmonilifome）[6]，寄生疫霉（Phytophthora nicotianae var.parasitica）[7]等，不同枸杞产区病原菌种类有较大差别，甘肃产区枸杞根腐病病原主要是腐皮镰刀菌（Fusarium solani）和尖孢镰刀菌（F.oxysporum），青海产区病原主要是尖孢镰刀菌（F.oxysporum），而新疆产区病原主要是寄生疫霉（P.nicotianae var.parasitica）和立枯丝核菌（R.solani）[5-7]。1994年，王国珍等[8]采用形态学的方法鉴定宁夏枸杞根腐病的病原为尖孢镰刀菌（F.oxysporum）、茄病镰刀菌（F.solani）、同色镰刀菌（F.concolor）和串珠镰刀菌（F.moniliforme）。多年来，随着宁夏枸杞品种更新和种植年限的延长，宁夏枸杞根腐病病原种类和数量已发生改变，但相关的研究报道较少。因此，本研究以从宁夏银川地区采集枸杞根腐病病株为材料，利用组织分离法获得纯化菌株，通过形态学和分子生物学相结合的方法进行菌株鉴定，旨在明确宁夏枸杞根腐病主要病原的种类和组成，为宁夏枸杞根腐病防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 枸杞根腐病标本采集及症状描述

2019年11月在宁夏银川森淼枸杞园，对地上部有疑似枸杞根腐病症状的植株随机挖取10株，进行根腐病的初步诊断和症状描述。将根腐病患病植株根部带回实验室，进行病原菌的分离鉴定，对典型症状拍照。

1.2 病原菌的分离

采用组织分离法[9]进行病原菌的分离，先用流水冲洗患病部位，在病健交界处切取5 mm×5 mm的病组织，用70%的酒精消毒30 s后，5%的次氯酸钠消毒3～5 min（依据组织大小延长或缩短消毒时间），随后无菌水冲洗3次，在无菌滤纸上吸干表面水分，转移至PDA平板上。置于25℃培养箱中培养3～4 d，待病组织周围长出菌丝时，用接种环挑取尖端菌丝进行纯化，纯化3次后的菌株接种在PDA斜面上，温度为4℃保存备用。

1.3 致病性测定

参照张贞明等浸根接种法[10]的方法:将宁杞5号品种枸杞种子播种于直径9 cm的塑料花盆中，置于温度为22～30℃的室内培育，至50 d时对枸杞苗根部稍有损伤，用孢子悬液浸根10 min后移至花盆继续生长，3次重复，用无菌水浸根做对照，接种菌株菌悬液质量浓度为106个孢子·mL-1。每天观察接种症状并对发病明显植株重新分离并鉴定病原菌。

1.4 病原菌的鉴定

1.4.1 形态学鉴定将病原菌接种于PDA培养基上，温度为25℃培养5 d，观察病原菌株在PDA培养基上的菌落特征（菌落形状、颜色、质地等），产孢后挑取菌丝进行镜检和拍照。根据菌株形态特征，参考《真菌鉴定手册》[11]和《镰刀菌属》[12]进行鉴定。

1.4.2 分子生物学鉴定将病原菌接种在PDA培养基上，带菌丝长满皿后，采用Biospin@真菌基因组DNA提取试剂盒提取病原真菌基因组DNA，采用通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）进行PCR扩增。扩增体系:DNA模板1μL，2×TaqMix酶12.5μL，引物各0.5μL，加ddH2O补足至25μL；扩增程序:94℃预变性3 min；94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，30个循环；72℃再延伸10 min。将PCR产物送上海生工生物有限公司测序，所测序列在GenBank中进行同源性比对并下载同源性较高的序列，登录号分别为MN559971.1、MT966030.1、MH172618.1、KJ866419.1、MT560375.1、MK729596.1、KT748520.1和MK174967.1。采用Mega X软件构建菌株系统发育树，明确病原菌分类地位。

2 结果与分析

2.1 枸杞根腐病症状观察

枸杞根腐病主要危害根部和茎基部，发病植株通常表现为叶片发黄、萎蔫，植物生长不良，严重时全株枯死，根茎部腐烂，剖开病部可见维管束变为褐色（图1A～1B）。环境湿度大时，病部可见白色或粉红色霉层（图1C）。

图1 枸杞根腐病症

2.2 病原分离及致病性鉴定

对枸杞根腐病病部进行病原菌分离、纯化，共获得38株纯化菌株，经形态学观察，合并菌落、孢子等形态学相同的菌株，初步鉴定认为所得菌株为4种类型，其中LR-1分离数目最多（17株），分离频率为44.74%；LR-5分离数目最少（3株），分离频率为7.89%（表1）。对这4类代表菌株进行致病性测定，发现接种4株菌株均可引起枸杞根茎部发病，与自然条件下枸杞根腐病症状相似，对发病部位再分离均可得到原接种所用菌株，确定以LR-1、LR-2、LR-4和LR-5为代表的4类真菌菌株均为造成枸杞根腐病的致病菌株。

表1 从宁夏地区枸杞根腐病病部分离的真菌菌株

2.3 病原菌形态鉴定

LR-1在PDA上菌落呈白色规则圆形，气生菌丝生长速度比较快（图2A）。小型分生孢子无色，卵圆形或椭圆形，大小为（5.1～13.2）μm×（2.1～3.7）μm；大分生孢子无色，镰刀形，3～5个分隔，大小为（22.6～39.7）μm×（3.6～4.9）μm（图2a）。初步鉴定为尖孢镰刀菌（F.oxysporum）。

LR-2在PDA上菌落呈圆形或近圆形，菌丝体出为灰白色上生长较快，后转为灰褐色（图2B）。菌丝呈锐角或直角，直径5.1～7.1μm（图2b）。初步鉴定为立枯丝核菌（R.solani）。

LR-4在PDA上菌落白色，气生菌丝棉絮状（图2C），小型分生孢子长椭圆形或棍棒型，大小为（6.5～17.2）μm×（2.6～3.4）μm，大型分生孢子中间粗，两端细，基部有足细胞，3～5个分隔，大小为（16.5～36.2）μm×（3.6～4.4）μm（图2c）。初步鉴定为木贼镰刀菌（F.equiseti）。

LR-5在PDA上菌落呈近圆形，菌丝无色绒状（图2D）。大型分生孢子镰刀形，2端较细，具2～8个隔膜，大小为（17.6～58.7）μm×（3.6～5.2）μm（图2d）。初步鉴定为变红镰刀菌（F.incarnatum）。

图2 枸杞根腐病病原真菌的形态特征

2.4 病原菌分子鉴定

利用引物ITS1/ITS4对病原菌基因组DNA进行PCR扩增，扩增产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，扩增片段大小为500～700 bp。将PCR产物送去测序，测序结果在GenBank中进行Blasts分析，下载相似性高的序列，用Mega X软件采用邻接法构建系统发育树（图3）。由图3可知，菌株LR-1与GenBank登录号为MN559971.1、MT966030.1的菌株聚在一起，同源性高达100%，为尖孢镰刀菌（F.oxysporum）。菌株LR-2与GenBank登录号为MH172618.1、KJ866419.1的菌株聚在一起，同源性达98%～100%，为立枯丝核菌（R.solani）。菌株LR-4与GenBank登录号为MT560375.1、MK729596.1的菌株聚在一起，同源性达96%～100%，为木贼镰刀菌（F.equiseti）。菌株LR-5与GenBank登录号为KT748520.1、MK174967.1的菌株聚在一起，同源性高达100%，为变红镰刀菌（F.incarnatum）。

图3 基于r DNA-ITS序列分析构建的系统发育树

3 讨论与结论

枸杞根腐病素有“植物癌症”之称，主要发生于枸杞的根和根茎部位，是枸杞栽培过程中的一类重要的土传病害，具有危害严重、防治难度大等特点[13]。本研究从宁夏银川市采集的枸杞根腐病病样中分离纯化获得4类菌株，在形态学上以Booth等分类特征为主[11，12，14]，结合rDNA-ITS序列分析为辅助手段，从宁夏枸杞产区根腐病患病植株分离到25株镰刀菌属菌株，其中尖孢镰刀菌（F.oxysporum）17株，木贼镰刀菌（F.equiseti）5株，变红镰刀菌（F.incarnatum）3株，另有13株立枯丝核菌（R.solani），其分离频率依次为44.74%、13.16%、7.89%和34.21%。通过致病测定，证明宁夏地区枸杞根腐病的病原为尖孢镰刀菌（F.oxysporum）、立枯丝核菌（R.solani）、木贼镰刀菌（F.equiseti）和变红镰刀菌（F.incarnatum），其可导致枸杞根茎部腐烂、维管束褐变，植株树势衰弱，甚至全株枯死。在分离到的多株病原菌中，尖孢镰刀菌（F.oxysporum）占多数，为优势病原菌，这与刘振荣[4]、李捷等[15]对青海、甘肃靖远地区枸杞根腐病的研究结果一致，但未发现从新疆产区枸杞根腐病病部分离的主要病原寄生疫霉（P.nicotianae var.parasitica）[7]。可见宁夏产区枸杞根腐病优势病原与其他产区存在较大差异，这可能与各产区地理位置、气候、土壤条件等有关。

1994年，王国珍等[8]报道宁夏枸杞根腐病是由尖孢镰刀菌（F.oxysporum）、茄类镰刀菌（F.solani）、同色镰刀菌（F.concolor）和串珠镰刀菌（F.moniliformesh eldon）复合侵染所致，且尖孢镰刀菌（F.oxysporum）、茄类镰刀菌（F.solani）是主要致病菌。本研究未能从根腐病病部分离到茄类镰刀菌（F.solani）、同色镰刀菌（F.concolor）和串珠镰刀菌（F.moniliformesheldon），但分离获得了木贼镰刀菌（F.equiseti）和变红镰刀菌（F.incarnatum），这是宁夏枸杞根腐病新病原的首次报道。目前宁夏广泛栽培的品种是宁杞5号和宁杞7号，推测可能是由于枸杞品种变化导致根腐病病原组成发生改变。国内学者普遍认为尖孢镰刀菌（F.oxysporum）是枸杞根腐病的主要致病菌[6]，寄主范围广泛，可引起番茄[16]、草莓[17]、小麦[18]等植物根部腐烂、维管束变褐，甚至植物萎蔫死亡[19]。致病性尖孢镰刀菌具有寄主特异性，根据寄主种类、品种已划分出150多个专化型[20]。但枸杞尖孢镰刀菌寄主范围尚未明确，后续将进一步针对其寄主范围、病原生物学、流行与防治展开深入研究。