张 倩，任 敏，苟 妍，陶金忠

（宁夏大学 农学院，宁夏 银川 750021）

0 引言

应激（Stress）这一观点最先是由加拿大的病理生理学家Hans Selye于1936年在《Nature》杂志上首次提出的。其基本定义被认为泛指机体在遭遇内外部刺激性因子的相互刺激下，所触发的一系列非特异性生理防御机制，其中，下丘脑垂体肾上腺的激活过程是整个反应过程中最主要的一种[1-3]。下丘脑垂体中的肾上腺轴突的活动直接受到位于下丘脑垂体中心室旁核（paraventricular hypothalamicnucleus，pvn）活动的影响。当机体大脑受到强烈刺激时，室旁核神经细胞分泌精氨酸加压素（avon）和促肾上腺皮质激素，从而使垂体产生和分泌促肾上腺皮质激素（Adreno-cortico-tropic-hormone，ACTH）。促肾上腺皮质激素随着血液流动到达肾上腺，刺激肾上腺皮质合成和分泌皮质醇[5-7]。随后，ACTH刺激肾上腺皮质释放皮质醇，而皮质醇反过来又向垂体提供负反馈，减少促肾上腺皮质激素的分泌，皮质醇是肾上腺在面临压力时产生的一种糖皮质激素，具备抑菌、抗炎、抗过敏、抗病毒等的作用，可显著的增强中枢神经系统的兴奋性[8]。正常情况下，机体通过控制皮质醇分泌和调节血液中皮质醇的含量来保持正常的生理功能。在应激状态下，机体内源性皮质醇产生量激增（至正常程度的10倍上下)来抵挡刺激，并产生针对性的应激反应。血液中的皮质醇浓度是权衡激素强度的一个指标。生产实践中，常用测量血液中乳糖皮质醇的平均含量值来评定奶牛的应激和其他疾病状态，但其浓度可能会同时受到血液采样和应激等因素的严重干扰[9-10]。

近年来，随着畜牧业的快速发展，应激的防治成为兽医临床关注的重点。大量研究表明，动物应激受生理性因素、环境性因素、管理性因素以及药物性因素的影响。长途运输后肉牛会出现运输应激综合征导致应激激素水平增加，也可能减少蛋白质的合成，降低生产性能和泌乳能力[11-13]。流行病学研究显示，应激刺激严重者可以使蛋鸡产蛋率从85%骤降到15%；德国每年由于运输应激而死亡的屠宰肉猪比例大约是0.2%；美国因运输应激而死亡的猪比例也很高，每年将近损失3 000万美元。可见，应激严重危害动物的健康。已成为亟待解决的问题之一。

在动物实验中，单栏饲喂是经常使用的一种饲养方式。单栏饲喂，虽便于饲喂管理，但限制了动物的活动及生存空间，是否会对动物产生应激，目前尚不清楚。本试验通过比较单栏饲喂和圈舍喂养两种不同饲喂方式对滩羊应激激素水平的变化，探究单栏饲喂对滩羊应激的影响。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

常用仪器与试剂，见表1。

1.2 试验动物与分组

本试验于2019年8—9月份从宁夏盐池滩羊育种场选取24只健康无病、月龄相近的滩羊，并随机将其分为2组（实验组与对照组），每组各12只，2组滩羊均饲喂基础饲粮，试验组进行单栏饲喂，对照组进行圈舍饲喂。分别于第1 d、第14 d和第24 d晨饲前采集试验滩羊颈静脉血样10 mL，加入肝素钠抗凝，在3 000 rpm条件下离心15 min后获得血浆，置于-20℃冰箱中冷冻保存待检。

1.3 样本预处理

从-20℃冰箱中取出血样，缓慢解冻后至常温，使用ELISA试剂盒检测第1 d、第14 d和第24 d血浆样品中皮质醇和ACTH含量。

1.4 ELISA检测

1）标准品的稀释和样品的添加:在酶标包被板上分别依序设置1个符合标准的乳化样品10孔，在第1和第2孔中分别依次稀释加入1个符合标准的乳化样品100μL，并且在第1和第2孔中分别依次加入2个标准新产品稀释液50μL依次混匀，然后从第1孔和第2孔中各取100μL分别依次加入混匀到第3孔和第4孔中，接着在第3孔和第4孔分别依次加2个标准品稀液50μL，混匀，然后再从第3孔和第4孔中分别取50μL混匀弃掉，再各取50μL分别依次加到第5和第6孔中，再在第5和第6孔中依次加入2个标准新产品稀释液50μL，混匀，混匀后从第5孔和第6孔中分别取50μL依次加到第7孔和第8孔中，再从第7孔和第8孔中分别依次加2个标准新产品稀释液50μL，混匀后再从第7孔和第8孔中分别取50μL依次加到第9孔和第10孔中，再从第9孔和第10孔分别依次加入2个标准新产品稀释液50μL，混匀后从第9孔和第10孔中分别取50μL别弃掉。（使用皮质酸乙醇溶液稀释后各孔径添加样物含量都为50μL，质量浓度分别为300、200、100、50、2.5μg/L；ACTH（稀释后各孔径添加样物含量都为50μl，质量浓度分别为90、30、15、7.5 ng/L）。

2）加样:分别设空缺孔（即在空缺对照板的孔隙内不加待测样品及其他酶标待测试剂，别的各步加样操纵并无差异)、待检预测酶标样品孔，在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μL，然后再加空缺待检预测酶标样品10μL（待测样品最后的稀释度为5倍），将待测样品试剂加于原酶标板孔底部，（尽量不直接碰触孔壁，轻轻左右摇晃使其混匀）。

3）温育:用封板膜封板后置37℃温育30 min。

4）配液:将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用。

5）洗涤:注意要仔细揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30 s后弃去，同上步骤反复5次，拍干。

6）加酶:每孔选项加入带有酶标记的试剂50μL，空白孔选项除外。

7）温育:操作同3。

8）洗涤:操作同5。

9）显色:每孔先加入显色剂B50μL，轻轻摇晃使之均匀混合，37℃避光显色15 min。

10）反应终止:每孔中添加一次终止液50μL之后该孔停止化学反应（此时孔由蓝色逐渐变为金黄色）。

11）测定:以空缺孔调零，420 nm波长依序丈量各孔的吸光度（OD值），测定应在加停止液之后15 min之内进行。

1.5 统计分析

首先通过Excel对测量数据进行排序后，采用SPSS 23.0软件对数据进行t检验显著性分析，所得的数据用“平均值±标准差”表示，显著性水平为（P＜0.05）。

2 结果

2.1 标准曲线

ACTH标准曲线为Y=46.435X+2.313 5，R2=0.984 8；皮质醇标准曲线为Y=188.54X+1.998，R2=0.987 7。说明两个曲线拟合良好。式中:X为溶液浓度，Y为吸光度。

2.2 对照组与试验组皮质醇与ACTH浓度变化

由表2可知，随着实验的进行，皮质醇浓度随时间的变化而呈下降趋势，且在3个时间点对照组与试验组之间差异不显著（P＞0.05）。

表2 皮质醇浓度随时间变化情况

由表3可知，随着实验的进行，ACTH浓度随时间的变化各组ACTH呈上升趋势，在第24 d时，对照组ACTH浓度极显著高于试验组（P＜0.01）。

表3 ACTH浓度随时间变化情况

3 讨论与结论

研究发现，动物在急性应激下，皮质醇激增。虽然最开始是在促肾上腺皮质激素水平大幅上升之前皮质醇才开始升高，但如果出现长期的炎症应激，促肾上腺皮质激素的水平会恢复到相近于基础水平，而皮质醇水平则由于肾上腺敏感性的增加而持续上升；在慢性应激状态下，垂体的下丘脑激活由促肾上腺皮质激素释放激素为主转变为精氨酸后叶加压素为主，皮质醇水平持续升高，至少部分原因是皮质醇代谢下降[14-15]。

大鼠在恐惧应激条件下其血浆中ACTH和皮质醇在血清中的含量明显高于常规，ACTH和皮质醇的含量可以反映垂体-肾上腺皮质轴的功效转变[16]。另有研究表明，当奶牛患有子宫内膜炎等疾病时，毛发中皮质醇浓度会升高，而当奶牛处于亚临床疾病状态时，毛发中皮质醇含量没有明显升高[17-21]。在国内，每年有超过5 000万头牛通过半挂车被运输，有研究表明，当奶牛在运输压力下，血清中的ACTH和皮质醇含量都会上升。当奶牛处于急性热应激时，血清皮质醇的含量也会升高，说明在应激刺激下，机体作为回应，其应激素ACTH和皮质醇会升高。

皮质醇用作评估动物压力程度的指标，其具有支持或调控机体代谢、免疫及稳态的功能，各种生理或病理因素会影响血浆皮质醇激素含量的变化。宋鹏康等人[22]研究发现，在妊娠前、中、后期，与自由产圈的相比，限位栏产圈下母猪皮质醇含量有一定程度的增加但差异不显著。本试验结果表明，单栏饲喂与圈舍饲养下2组滩羊血浆皮质醇激素水平差异不显著。这与宋鹏康[22]等人的研究结果基本相一致。说明单栏饲喂虽然限定了羊只自由活动，但不影响滩羊皮质醇的分泌。上述试验经由神经内分泌和血液生理指标的转变，提高人体适应环境转变的本领，从而保证生命活动的正常进行。在单栏饲喂第24 d的滩羊ACTH浓度低于对照组，说明在单栏饲喂的过程中，皮质醇和ACTH两种应激激素的分泌并未受到显著影响，推断单栏饲喂不对滩羊产生应激反应或受到的应激反应很小。