齐丽娜,蒋静乐,陶生祥,张婧菲,张莉莉,王恬

(南京农业大学动物科技学院,江苏 南京 210095)

母猪的繁殖力是影响其养殖效益的重要因素。宫内发育迟缓(intrauterine growth retardation,IUGR)是指妊娠期胎儿生长发育迟缓,通常表现为初生体重低和组织器官发育受损[1]。目前常用于判断IUGR的标准为初生体重低于群体平均值的10%或低于平均值的2个标准差。IUGR不仅导致胎儿在新生期的发病率与死亡率升高,而且对其出生后的生长发育也会产生不良影响[2]。

胎盘是妊娠期母体和胎儿之间营养物质和气体交换的重要组织器官,对胎儿的发育至关重要[3]。胎盘功能不全是宫内发育迟缓的重要原因。Finch等[4]的研究表明,低胎盘重会损伤胎盘功能从而提高胎儿IUGR的发生率。Chen等[5]也研究报道称,妊娠期维生素D缺乏可通过诱发胎盘炎症引起胎盘功能不全和胎儿宫内生长受限。猪作为一种多胎家畜,发生IUGR的概率较大,因为血管分布数量的差异,子宫末端的IUGR发生率要高于子宫角中部[6-7]。猪器官结构和生理功能与人类相比极为相似,因此,IUGR猪常被用作研究人类IUGR的动物模型。

本试验以猪胎盘为研究对象,应用免疫组织化学和末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸缺口末端标记(Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated deoxyuridine triphosphate nick-end labeling,TUNEL)法研究宫内发育迟缓对猪胎盘细胞增殖及凋亡的影响,同时应用荧光定量PCR和蛋白免疫印迹等技术,研究宫内发育迟缓对猪胎盘抗氧化基因及蛋白表达的影响,为深入研究胎盘发育提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验样本

从江苏镇江丹阳市采集刚分娩的猪胎盘,部分胎盘组织置液氮速冻后,于-80 ℃冰箱中保存,用于提取蛋白质和RNA;部分胎盘组织置4%多聚甲醛溶液中固定。根据Hu等[8]的研究结果将胎盘分为对照组和宫内发育迟缓组。

1.2 主要试剂与器材

Trizol购自TaKaRa,TUNEL-BrightRed凋亡检测试剂盒购自南京诺唯赞,鼠抗PCNA购自Abcam(AB29),SABC免疫组化试剂盒(羊抗兔/鼠)购自武汉博士德,HRP标记的羊抗兔IgG(SA00001-2)和羊抗小鼠IgG(SA00001-1)购自Proteintech。其他试剂均为国产分析纯。

1.3 免疫组织化学法分析胎盘细胞增殖

采用SABC法测定胎盘细胞增殖。具体方法如下:胎盘样品室温固定24 h,经过一系列浓度梯度的乙醇和二甲苯分别脱水和透化处理,石蜡包埋,切成5 μm厚度的组织切片,置于经3-氨丙基三乙氧基硅烷处理之后的玻片上,于37 ℃烘片机烘24 h。制作好的石蜡切片再经系列浓度梯度的二甲苯和乙醇分别脱蜡和水化处理,流水冲洗后,浸在预热的柠檬酸钠中继续煮沸修复抗原,冷却后流水冲洗5 min。用含甲醇和30% H2O2的PBS溶液裂解细胞并灭活内源性过氧化氢酶。洗净后,用5%(体积分数)的小牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)封闭1 h,加PCNA一抗(鼠抗,1∶10 000稀释),4 ℃孵育过夜。以PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照。取出后用PBS洗3次,每次5 min,加入生物素标记的兔抗IgG抗体(1∶100 稀释),室温孵育2 h,再洗净与SABC试剂反应1 h,3,3-二氨基联苯胺(DAB)显色2 min,在显微镜下掌握染色深浅程度,流水冲洗5 min,苏木素复染,脱水透明,封片。显微镜下观察,有棕黄色者为阳性,使用尼康相机(Nikon YS100)采集图像。

1.4 TUNEL法检测胎盘细胞凋亡

参照Jiang等[9]的方法,采用TUNEL-BrightRed凋亡检测试剂盒检测胎盘细胞凋亡。对胎盘石蜡切片进行脱蜡,再水化,在室温下用蛋白酶K(20 μg·mL-1)孵育20 min;在黑暗环境下用含双蒸水的重组末端脱氧核苷酸转移酶(terminal deoxyribonucleotidyl transferase,TdT)缓冲液、平衡缓冲液、亮红色标记混合液和TdT酶在37 ℃孵育60 min;用DAPI染色5 min。阴性对照按上述方法进行,但不孵育TdT酶缓冲液,以确保试验中不出现非特异性反应。通过LSM900共聚焦激光扫描显微镜扫描获得图像。用Image Pro Plus 6.0软件计算凋亡细胞数(红色)和总细胞数(蓝色)。凋亡率=凋亡细胞数/总细胞数×100%。

1.5 RT-PCR分析胎盘抗氧化相关基因mRNA表达

使用Trizol试剂提取胎盘总RNA,检测其完整性。采用超微量分光光度计确定总RNA浓度和纯度后,用DEPC水将RNA浓度统一配制至500 ng·μL-1。反转录(RT):用20 μL反应体系,参照TaKaRa反转录试剂盒说明书的方法操作。反转录条件:37 ℃ 15 min,85 ℃ 5 s。反转录产物cDNA保存于-20 ℃待用。qPCR基因引物序列见表1(由上海生工公司设计并合成)。采用20 μL qPCR 反应体系:SYBR 10 μL,DEPC水6.8 μL,上、下游引物各0.4 μL,Rox参考染料(50×)0.4 μL,cDNA模板2 μL。qPCR反应程序:95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s,60 ℃ 1 s,40个循环。每个样品各3个重复。以β-actin作为内参基因,以对照(Con)组目的基因的表达为基准,用2-ΔΔCT法计算各目的基因的相对表达量。

表1 实时荧光定量PCR(RT-qPCR)所用引物序列Table 1 The primer sequences for RT-qPCR

1.6 用Western blot技术分析胎盘抗氧化相关蛋白表达

用RIPA裂解法提取胎盘组织总蛋白,BCA法测定蛋白浓度。在每份蛋白样品中加入等量的5×SDS上样缓冲液,将样品及蛋白标准品加入加样孔中,70 V电泳40 min,然后90 V电泳约1.5 h,至目的条带跑到理想位置。根据蛋白标准品的指示标记,将目标胶块切下,裁剪合适大小的PVDF膜,在甲醇中浸泡 1 min 后,通过湿转法将蛋白转移至PVDF膜上,转膜电压70 V,时间70 min。封闭:将PVDF膜取出,TBST清洗3次后加入适量5% BSA,置于摇床上,室温孵育2 h;加入一抗,4 ℃过夜(一抗NRF2购自 Proteintech,HO-1购自Abcam公司,β-actin抗体购自Proteintech公司);用TBST在摇床上清洗膜3次,加入适量二抗,置于摇床上室温孵育2 h。显影:使用ECL发光液浸泡PVDF膜,再放于荧光成像仪(Bio-Rad)下曝光并拍照。应用Image J软件进行灰度分析。

1.7 数据统计与分析

2 结果与分析

2.1 宫内发育迟缓对猪胎盘细胞增殖的影响

增殖细胞核抗原(PCNA)是一种参与调控细胞周期的核蛋白,在增殖细胞中特异性表达,细胞核内PCNA的表达水平高低与细胞增殖活性密切相关[10-11]。PCNA在胎盘细胞中的表达采用棕黄色显示,结果如图1所示,对照组(Con)可以观察到较强的PCNA的免疫染色,宫内发育迟缓组PCNA染色较弱。说明对照组与宫内发育迟缓猪胎盘细胞相比,细胞增殖活力较强[12]。

图1 宫内发育迟缓(IUGR)对猪胎盘细胞增殖的影响Fig.1 Effect of intrauterine growth retardation(IUGR)on proliferation of porcine placental cells

2.2 宫内发育迟缓对猪胎盘细胞凋亡的影响

应用TUNEL法检测胎盘细胞凋亡,胎盘细胞凋亡用红色表示。从图2可见:IUGR组和Con组细胞凋亡率分别为19.63%与12.56%,IUGR组细胞凋亡率明显高于对照组(P<0.05)。

图2 宫内发育迟缓对猪胎盘细胞凋亡影响的染色观察(A)和统计分析(B)Fig.2 Effect of IUGR on apoptosis of porcine placental cells with staining(A)and statistical analysis(B)*P<0.05. 下同The same below.

2.3 宫内发育迟缓对猪胎盘抗氧化相关基因mRNA表达的影响

从图3可见:与对照组相比,宫内发育迟缓猪胎盘NRF2、NQO1、SOD1、SOD2、GCLC和GCLMmRNA的表达水平显著降低(P<0.05),HO-1mRNA的表达在正常猪胎盘和宫内发育迟缓猪胎盘组间差异不显著。

图3 宫内发育迟缓对猪胎盘抗氧化基因mRNA表达水平的影响Fig.3 Effect of IUGR on mRNA expression of antioxidant gene in porcine placenta

2.4 宫内发育迟缓对猪胎盘抗氧化相关蛋白表达的影响

应用Western blot技术检测宫内发育迟缓对猪胎盘细胞抗氧化蛋白表达的影响。结果如图4所示:对照组与宫内发育迟缓组NRF2和HO-1蛋白相对表达水平差异不显著。

图4 宫内发育迟缓对猪胎盘抗氧化蛋白表达水平的影响Fig.4 Effect of IUGR on the expression level of antioxidant protein in porcine placenta

3 讨论

3.1 宫内发育迟缓对猪胎盘细胞增殖的影响

哺乳动物胎盘不仅是母体和胎儿营养物质交换的场所,同时也是胎儿代谢物排泄的场所[13]。胎盘发育异常将导致自然流产、先兆子痫、宫内发育迟缓和葡萄胎等妊娠性疾病的发生发展。胎盘细胞的发育和功能依赖于细胞增殖与细胞死亡之间的平衡。Alqaryyan等[14]研究发现,由地塞米松诱导的宫内发育迟缓大鼠胎盘PCNA的表达显著降低。de Unek等[15]研究发现,与对照组相比,IUGR组基底膜和绒毛膜中PCNA染色强度显著下降。本试验的免疫组化染色结果显示,宫内发育迟缓猪胎盘PCNA的表达显著下降,与上述结果相似,这可能是导致IUGR仔猪初生体重显著降低的原因之一。

3.2 宫内发育迟缓对猪胎盘细胞凋亡的影响

细胞凋亡作为维系器官细胞正常新陈代谢和器官正常生理功能的生物学现象,贯穿于胎盘发育的整个过程,对维持胎盘生长发育和生理功能至关重要[16]。IUGR与胎盘细胞过度凋亡密切相关[17]。笔者前期研究结果发现,由低蛋白日粮诱导的IUGR小鼠胎盘细胞显著凋亡[18]。肖超群等[16]也通过低蛋白饮食喂养、皮下注射尼古丁及自然选择的方法建立3种IUGR大鼠模型,结果发现3种因素所致大鼠胎儿生长受限胎盘细胞凋亡率均显著升高。陈华等[19]采用HE染色和TUNEL等方法研究发现IUGR胎盘组织明显发生凋亡。本试验中,IUGR胎盘细胞显著凋亡,与前人研究结果相似。这些结果提示猪胎盘细胞凋亡可能是胎儿发生IUGR的原因之一。

3.3 宫内发育迟缓对猪胎盘细胞抗氧化基因表达的影响

NRF2信号通路涉及多种代谢和抗氧化酶的调控,这些酶参与调节氧化应激和凋亡[20]。当细胞处于稳定状态下,NRF2稳定表达在细胞质中,并与组蛋白结合,其中包括胞浆抑制剂Keap1。当受到刺激时,它与Keap1分离,并游离到细胞核中与ARE结合,以调节下游抗氧化基因(SOD1、GCLC和GCLM)的转录[21]。SOD2位于线粒体基质内,线粒体基质是电子传递链产生超氧自由基的主要场所。SOD2介导的线粒体内超氧阴离子向过氧化氢的转化可以促进过氧化氢从线粒体基质中释放,从而避免能量产生部位的氧自由基过多[22-23]。NRF2是机体抗氧化应激的中枢调节者,在参与细胞抗氧化应激和外源性有毒物质诱导的防御机制中发挥重要作用[24]。当其在体内被有毒有害物质激活后进入细胞核与抗氧化反应元件结合形成NRF2-ARE信号通路,使下游一系列起到保护机体的Ⅱ相解毒酶和抗氧化酶基因及蛋白表达,包括HO-1、NQO1和SOD1等[25]。HO-1是该通路中发挥功能的主要酶,可以在体内中和过量的亚铁血红素,从而在一定程度上缓解机体的氧化应激[26]。笔者前期研究发现,由低蛋白饮食诱导的IUGR小鼠胎盘NRF2和HO-1mRNA的表达量也显著降低[18]。Kweider等[27]报道,NRF2敲除小鼠胎儿的体重显著降低,表明NRF2对胎儿生长发育具有重要作用。本研究结果显示,IUGR猪胎盘NRF2、SOD2、GCLC和GCLM的表达量显著降低,与前人研究结果相似。因此,我们推测胎盘抗氧化基因表达量显著降低也可能导致胎儿IUGR发生。

综上,IUGR组猪胎盘PCNA表达量显著降低,细胞凋亡率升高,且抗氧化基因表达量显著降低,导致IUGR猪胎盘易发生氧化应激,这可能是导致仔猪出生体重低的原因之一。