胡 月,刘建华,王雪竹,车传忠,吴桂灵,加尔肯,冉多良

(新疆农业大学 动物医学学院，新疆 乌鲁木齐 830052)

马疱疹病毒1型(equine herpesvirus 1，EHV-1)被广泛认为是一种与马呼吸道感染相关的病原体，此外它还能引起孕马流产、新生儿死亡和马疱疹病毒脊髓脑病(equine herpesvirus myeloencephalopathy，EHM)，不同EHV-1毒株感染引起的临床症状差异明显[1]。其所致疾病名为马疱疹病毒-1型感染(infection with equine herpesvirus-1)，在世界范围内普遍存在。我国农业农村部海关总署将该病列为二类动物传染病[2]。据历年的血清学调查显示，该病在我国的分布广泛[3]。2018—2019年新疆部分地区该病的阳性率高达39.34%，疫情形势严峻，给马产业健康发展带来了极大威胁[4]。

与其他疱疹病毒一样，EHV-1能在其宿主体内建立潜伏感染。无症状感染者会出现间歇性排毒，使得病毒在马群中传播，可导致EHV-1相关疾病的意外暴发[5]。由EHV-1引起的大规模流产和围产期小马驹死亡是造成经济损失的重要原因，而EHV-1相关呼吸系统疾病导致赛马的训练时间损失和比赛成绩差、EHM的暴发导致赛马淘汰等情况同样是制约马业发展的重要因素[6]。因此，需要快速和可靠的诊断工具来检测EHV-1感染，以便能及时采取措施减少病毒传播的影响。

常用的诊断方法中，病毒分离鉴定法操作复杂、费时费力且安全性低；血清学诊断方法的结论性较低，需要急性和恢复期血清样本；聚合酶链式反应(PCR)检测方法的敏感性较低，具有假阳性的风险，尤其是批量样品检测时易污染，这些方法均不适用于病毒的早期诊断[7]。而实时荧光定量PCR反应操作简单，结果直观，适合大批量样品检测，可以准确地进行病毒DNA的定量，有利于疾病的早期诊断和潜伏感染检测[8]。本研究旨在建立一种高特异性、灵敏性的针对EHV-1的TaqMan实时荧光定量PCR方法，以便在临床或实验室中对EHV-1进行快速诊断和定量分析，以清除EHV-1病原携带马匹，为我国马业的发展保驾护航。

1 材料与方法

1.1 毒株与细胞EHV-1 XJ2015株、RK-13细胞系、马疱疹病毒2型(EHV-2)、马疱疹病毒4型(EHV-4)、马疱疹病毒5型(EHV-5)、马动脉炎病毒(equine arteritis virus，EAV)基因组由新疆农业大学动物医学学院保存；马流感病毒(equine influenza virus，EIV)基因组由哈尔滨兽医研究所馈赠。

1.2 主要试剂和仪器Prime STAR®Max Polymerase和荧光定量PCR Probe Mix购自宝生物工程(大连)有限公司；pEASY®-Blunt 3 Cloning Kit和Trans1-T1 感受态细胞购自北京全式金生物公司；2×Taq plus MasterMix(含染料)购自Biosharp公司；病毒DNA的抽提试剂盒、DNA的胶回收纯化试剂盒和DNA质粒的小量提取试剂盒购自Omega Bio-Tek公司；其他常规试剂均为国产分析纯。实时荧光定量PCR仪(Fast 7500)购自美国ABI公司。

1.3 引物设计合成参照NCBI中GenBank收录的EHVs基因组序列，与本实验室已分离鉴定的EHV-1 XJ2015株，通过BioEdit及ClustalX软件对病毒的全基因组序列进行比对，筛选出特异性较高的ORF68基因作为靶基因。针对ORF68基因的保守区域设计1对特异性引物及探针由上海生物工程股份有限公司合成。ORF68-F：5′-CGTATTGGCATCTGAACCGC-3′；ORF68-R：5′-CTACA-CGCCTTTGGTAGGG-3′；TaqMan探针：5′-FAM-CCCATAGTGGTACGCTCCGCCGATCTCT-BH-Q1-3′。

1.4 标准质粒的制备以EHV-1 XJ2015株全基因组DNA为模板，用ORF68-F/R引物进行扩增。回收目的片段并与pEASY-Blunt 3载体连接，转化至Trans1-T1感受态细胞培养，抽提重组质粒进行测序，结果无误后测定质粒浓度并转换为拷贝数，即为标准品，并于-20℃保存备用。

1.5 荧光定量PCR方法的建立根据荧光定量PCR Probe Mix说明书优化反应体系，最终确定体系为20.00 μL，其中Probe qPCR Mix(2×)10.00 μL，Probe(0.35 μmol/L)0.70 μL，Rox 0.20 μL，上、下游引物(0.10 μmol/L)各0.20 μL，模板2.00 μL，RNase free H2O 6.70 μL。反应条件：95℃预变性20 s，95℃变性3 s，60℃退火30 s，40个循环。将标准品进行10倍梯度稀释，以此为模板进行荧光定量PCR，每个浓度设3个重复，设阴性对照，绘制标准曲线。

1.6 敏感性、特异性及重复性试验以8个不同浓度的标准质粒为模板，进行荧光定量PCR和常规PCR反应，对比2种方法的敏感性。以EHV-1、EHV-2、EHV-4、EHV-5、EAV及EIV的核酸为模板，使用标准质粒作为阳性对照，RNase free H2O作为阴性对照，进行检测以验证该方法的特异性。分别取3个浓度的标准质粒为模板，按确定的条件进行荧光定量PCR以分析组间重复性;每个稀释度3个重复，以分析组内重复性,计算Ct值的变异系数(CV)，评估重复性。

1.7 临床样品的检测将2020年收集自新疆伊犁地区的60份伴有呼吸系统疾病症状的马匹鼻拭子分别用本研究建立的荧光定量PCR方法与宋焕堂等[9]建立的EHV-1 SYBR GreenⅠ荧光定量PCR法以及常规PCR方法进行检测，比较2种方法的检测结果。

2 结果

2.1 ORF68基因遗传进化分析EHV-1 XJ2015株 ORF68基因核苷酸序列长度为1 653 bp，经基因相似性分析表明，XJ2015株 ORF68基因与EHV-1毒株相似性在75.2%～100.0%，其中，与分离自瞪羚的94-137株和分离自中亚野驴的T-529株相似性均为75.2%，与分离自马匹的毒株相似性为99.9%～100.0%,而与EHV-2、EHV-3、EHV-4、EHV-5、EHV-8、EHV-9同源性为28.5%～70.6%；经基因遗传进化树分析表明，ORF68基因可以将不同马疱疹病毒分别聚类(图1)。

A.相似性分析；B.遗传进化树

2.2 标准品的制备重组质粒拷贝数为1.02×1010拷贝/μL，在1.02×103～ 1.02×109拷贝/μL具有良好的线性关系(图2)，回归方程：y=-3.129(x)+46.402，相关系数R2=0.999，扩增效率E=1.089。

图2 荧光定量PCR方法的标准曲线

2.3 敏感性试验结果结果表明，荧光定量PCR方法能检出的最低拷贝数为1.02×101拷贝/μL(图3)，而常规PCR方法检出的最低拷贝数为1.02×104拷贝/μL(图4)。该荧光定量PCR方法是常规PCR方法敏感性的1 000倍，表明该方法具有较高的灵敏性。

1～8.标准品浓度依次为1.02×107～1.02×100 拷贝/μL；9.阴性对照

M.DL2000 DNA Marker；1.阴性对照；2～10.1.02×108 ～1.02×100 拷贝/μL标准品

2.4 特异性试验结果结果表明该方法仅能扩增重组质粒及EHV-1的核酸，其他病原及阴性对照均无特异性扩增(图5)，表明该方法具有良好的特异性。

1．重组质粒；2．EHV-1；3．EHV-2；4．EHV-4；5．EHV-5；6．EAV；7．EIV；8．阴性对照

2.5 重复性试验结果结果显示，批次内试验变异系数在0.8%～1.5%，批次间试验变异系数在1.8%～2.0%，批次间和批次内重复性试验，Ct值的变异系数均小于等于2.0%，表明该方法具有良好的重复性和稳定性(表1)。

表1 荧光定量 PCR 重复性试结果

2.6 临床样品检测结果本研究建立的EHV-1 TaqMan荧光定量PCR检测方法判定标准：Ct值小于35，扩增曲线良好可判定为阳性；Ct值在35～38需进行重复试验，2次试验的扩增曲线均有良好的线性关系(“S”型)则判定为阳性，Ct值大于38的判定为阴性。检测显示，常规PCR、SYBR Green Ⅰ 荧光定量PCR、TaqMan荧光定量PCR的阳性检出率分别为21.67%，23.33%，26.67%；TaqMan荧光定量PCR检出的阳性样品数最多，且包含了另2种方法检出的所有阳性样品；随机选取10份使用TaqMan荧光定量PCR检测为阳性的临床样本扩增产物进行序列测定，测序结果进行比对分析表明，所有扩增产物与EHV-1 XJ2015株ORF68基因片段相似性为100.00%，进一步证实扩增产物中含有EHV-1核酸。由此证明本研究建立的方法更为敏感、准确，可应用于临床检测(表2)。

表2 临床样品检测结果

3 讨论

EHV-1是疱疹病毒目，疱疹病毒科，α疱疹病毒亚科，水痘病毒属的一员。马疱疹病毒3型(EHV-3)、EHV-4、马疱疹病毒8型(EHV-8)和马疱疹病毒9型(EHV-9)也属于α亚科。EHV-2和EHV-5属于γ亚科。这些马疱疹病毒的临床症状有相似之处，且均具有相同结构的线性双链基因组[10]。但由于EHV-1和EHV-4均能引起马属动物呼吸系统疾病，曾被认为是马鼻肺炎的病原体，研究者们一直将区分EHV-1和EHV-4当作研究的重点。然而，对不同马疱疹病毒的氨基酸序列鉴定分析表明，EHV-8和EHV-9与EHV-1的亲缘关系更密切，传统的检测方法无法有效地将他们区分[11]。2003—2015年，从爱尔兰马流产病例中分离出的2株EHV-8病毒最初被误诊为EHV-1[12]。2010年，中国东北的马流产病例中分离得到了EHV-8毒株(Wh株)，并首次获得了EHV-8的全基因组序列[13]。EHV-9最初被命名为瞪羚疱疹病毒1型，因其可以与EHV-1发生血清学交叉反应且在遗传上接近EHV-1而最终被重新命名为EHV-9[14]。据报道，自然感染EHV-9会导致长颈鹿和北极熊致命的脑炎，试验感染表明EHV-9可以引起仓鼠、小鼠、马和山羊的脑炎[15]。EHV-9具有广泛的宿主范围和强烈的神经趋向性，而EHV-1通常只在叙利亚仓鼠和马匹中显示神经致病性[16]。目前，中国新疆没有关于EHV-8或EHV-9疫情的报告，但无法排除EHV-8或EHV-9流行的可能性。

本研究通过对NCBI收录的EHV-1、EHV-3、EHV-4、EHV-8和EHV-9的77个基因序列比对分析时发现ORF68基因在马疱疹病毒中的同源性最低，而在EHV-1中表现出较高的保守性，在马源性毒株中的相似性高达99.9%～100.0%。因此，根据该基因为靶标设计特异性引物和探针，建立了EHV-1 TaqMan探针荧光定量PCR检测方法。但由于未能收集到EHV-8和EHV-9的核酸样本，本研究仅对其他几种马病毒(EHV-2、EHV-4、EHV-5、EAV、EIV)进行检测，均呈阴性,显示该方法具有良好的特异性。灵敏度研究表明，该方法的最低病毒检出量为10.20 拷贝/μL，是常规PCR方法的1 000倍，与2016年宋焕堂等[9]建立的EHV-1 SYBR Green Ⅰ(最低检出量为23.00 拷贝/μL)和2019年林志雄等[17]建立的马鼻肺炎双重荧光定量PCR检测方法(最低检出量为147.00 拷贝/μL)相比，敏感性更好。虽然本方法的灵敏度比2020年雷程红等[18]建立的马疱疹病毒1型3D数字PCR检测方法略低(最低检出量为5.83拷贝/μL，变异系数为0.65%～3.20%)，但重复性更具优势。此外，本研究建立的TaqMan探针荧光定量PCR检测方法操作简单，反应成本较低，可在60 min内快速批量检出EHV-1的阳性率及病毒载量，可用于EHV-1的快速诊断、分子流行病学调查及潜伏感染调查，也可通过定量分析病毒基因拷贝数，为EHV-1相关疫苗及药物的安全性、有效性等指标提供检测方法，具有较广泛的实际应用前景。