伍辉吉，赵 丹，陈济铛，张溢珊，朱婉君，张济培*

(1.佛山科学技术学院 生命科学与工程学院，广东 佛山528231；2.佛山万牧洲生物科技有限公司，广东 佛山 528231)

星状病毒(astroviruses,AstV)为无囊膜，单股正链RNA病毒，基因组全长约为6.8～7.9 kb[1]。5′非编码区(5′UTR)开始紧接着3个开放阅读框(ORF1a、ORF1b、ORF2)、3′非编码区(3′UTR)以及多聚腺苷酸尾巴(poly-A tail)，其中ORF1a与ORF1b编码非结构蛋白，ORF2编码衣壳蛋白(capsid protein,CP)[2]。国际病毒分类学委员会(ICTV)根据感染宿主的不同将星状病毒科划分为2个不同的病毒属：哺乳动物星状病毒属(Mamastrovirus,MAstV)和禽星状病毒属(Avastrovirus,AAstV)，并规定ORF2全长氨基酸序列的平均氨基酸遗传距离为0.576～0.741,可划分为不同种的星状病毒[3]。ORF2编码的衣壳蛋白，包括保守的N端和高变的C端，N端主要为衣壳壳体蛋白结构域，C端主要为纤突蛋白(Spike)结构域，是病毒主要的免疫原性蛋白[4]。YORK等[5-7]的研究均显示通过重组系统表达的衣壳蛋白C端具有良好的免疫原性及反应性。

2015年以来，中国山东、河南、河北、湖南、广东、福建、黑龙江等地雏鹅群中相继暴发致死性雏鹅内脏痛风。YUAN等[8-10]均于出现痛风症状的雏鹅体内分离获得2型鹅星状病毒(GoAstV-2)，并通过病例复制试验证实2型鹅星状病毒与雏鹅致死性内脏痛风相关。目前针对雏鹅致死性内脏痛风大多处于对症治疗阶段，尚无有效商品化疫苗用于雏鹅致死性内脏痛风的防控，严重威胁我国养鹅产业的发展。

本试验对实验室分离鉴定保存的1株鹅星状病毒的ORF2即衣壳蛋白基因进行序列测定，通过同源比对、系统发育树构建、氨基酸平均遗传距离计算了解分离株分子进化情况。通过推导的氨基酸序列，预测衣壳蛋白纤突结构(Spike)并通过生物信息学分析了解Spike蛋白的变异情况、理化性质及结构特征。运用pET-30a表达载体及BL21(DE3)表达菌株完成Spike重组蛋白表达质粒的构建及初步表达，免疫新西兰白兔获得Spike蛋白多克隆抗体，以期为鹅星状病毒Spike蛋白功能研究、血清学检测方法的建立以及亚单位疫苗的制备奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 毒株与衣壳蛋白来源毒株由佛山科学技术学院禽病研究所2018年11月从广东省肇庆市发生雏鹅痛风的鹅厂中采集的组织样品中分离获得，命名为AstV/goose/Guangdong/1811LHC/2018，简称LHC株。鹅星状病毒衣壳蛋白由佛山科学技术学院禽病研究所以LHC株为模板构建原核表达质粒表达并纯化获得。

1.2 主要试剂TransZol Up Plus RNA Kit，BL21(DE3) Chemically Competent Cell(北京全式金生物技术公司)；PrimeScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit，TaKaRa LA Taq，E.coliDH5α Competent Cells，PMD18-T Vector(宝日生物技术(北京)公司)；Gel Extraction Kit(200)(OMEGA公司)；pET-30a(+)(优宝生物科技公司)；限制性内切酶NdeⅠ，XhoⅠ，T4连接酶(New England Biolabs 公司)；His标签蛋白纯化试剂盒，IPTG(碧云天生物技术公司)；His标签鼠单克隆抗体、HRP标记的羊抗鼠IgG(康为世纪公司)；HRP标记的羊抗兔IgG(武汉三鹰生物技术公司)；弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂(Sigma 公司)。

1.3 衣壳蛋白基因序列测定与分析根据GenBank中保存的鹅源星状病毒全基因序列(AXI69840)针对编码衣壳蛋白的ORF2设计特异性扩增引物JD256：5′-AGTCGGGCCCGACTTCT-3′；JD257：5′-CTGTACCCTCGATCCTACTCG-3′，预期扩增片段大小为2 215 bp。运用TransZol Up Plus RNA Kit试剂盒提取病毒总RNA，PrimeScr-ipt Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit进行反转录获得cDNA。运用引物JD256/JD257以cDNA为模板进行PCR扩增，产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，Gel Extraction Kit(200)试剂盒对目的条带进行回收纯化。回收后的产物与PMD18-T载体连接并转化至DH5α感受态细胞，均匀涂布于含氨苄的LB平板上。筛选出的阳性克隆菌株送至生工测序，测序结果上传至NCBI。

应用EditSeq对测得序列进行ORF定位，并推导获得LHC株衣壳蛋白氨基酸序列。应用Conserved Domain Search进行保守结构域分析，MegAlign对LHC株与GenBank数据库中已有的星状病毒衣壳蛋白氨基酸序列做相似性分析，MEGA 7.0对其进行遗传距离分析并绘制系统发育树。

1.4 纤突蛋白理化特性分析根据Conserved Domain Search保守结构域分析结果推导获得纤突蛋白编码序列，并通过ExPAsy服务器的Protaram程序分析纤突蛋白理化性质，I-TASSER进行二级结构预测，ESpript对LHC株纤突蛋白与其他鹅星状病毒进行二级结构及氨基酸序列多重比对。

1.5 纤突蛋白的原核表达及纯化根据LHC株测序结果针对Spike基因序列设计特异性扩增引物。HJ-F1： 5′-TCTCATATGCAGGTTACACCCTCG-CTT-3′;HJ-R1：5′-TTGCTCGAGGTCAGTCTCA-TCTTCCGCTGT-3′,引入双酶切位点NdeⅠ和XhoⅠ，预期目的片段大小为711 bp。运用引物HJ-F1/HJ-R1以1.3所获cDNA为模板进行PCR扩增，PCR产物胶回收，获得含有双酶切位点的编码纤突蛋白的cDNA片段，分别对回收的纤突蛋白cDNA片段与原核表达载体pET-30a(+)(Kan+)进行NdeⅠ和XhoⅠ内切酶双酶切处理后回收，并将回收后载体与片段以1∶3混合后加入T4连接酶，16℃恒温连接过夜，连接产物转化至DH5α感受态细胞，均匀涂布于卡那霉素抗性平板。通过双酶切鉴定与测序验证获得重组质粒命名为pET-30a-Spike。

pET-30a-Spike重组质粒转化至大肠杆菌BL-21表达菌株，筛选阳性菌株接种至Kan+(50 mg/L)LB肉汤，振荡培养过夜的菌液按1∶100接种至新鲜Kan+LB肉汤，振荡培养(37℃，200 r/min)至D600值为0.6左右，加入IPTG(终浓度1 mmol/L)37℃、100 r/min诱导表达6 h。含pET-30a(+)的对照菌株进行同步诱导表达。重组纤突蛋白预期大小为26.8 kDa，C端含有His标签。培养好的菌液离心后用PBS重悬，超声破碎后再离心，分别收集上清和沉淀，SDS-PAGE电泳分析重组蛋白的可溶性。

经SDS-PAGE电泳进行初步鉴定后，按照His标签蛋白纯化试剂盒说明书对目的蛋白进行纯化。纯化后的蛋白以1∶2 000比例稀释的抗His的鼠单克隆抗体为一抗，1∶10 000比例稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG为二抗进行Western blot验证。运用截留相对分子质量(MWCO)为10 kDa的蛋白超滤管对纯化后的纤突蛋白溶液进行离心浓缩后加入适量PBS再离心进行纤突蛋白溶液的脱盐和缓冲液更换，并运用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定纤突蛋白浓度，计算蛋白得率。

1.6 纤突蛋白多克隆抗体的制备及鉴定选择8周龄，雌性，新西兰兔作为免疫动物。初次免疫：取0.4 mg 蛋白加PBS至总体积500 μL，与等量弗氏完全佐剂混匀并乳化后，皮下分点注射(4个部位，两侧腹股沟和腋窝)；初免14 d后二次免疫：取0.2 mg 蛋白加PBS至500 μL，与等量弗氏不完全佐剂混匀并乳化后，皮下注射；二免14 d 后第3次免疫：取0.1 mg蛋白加入100 μL PBS，不加佐剂，静脉注射。于第2次加强免疫后7 d 耳缘静脉采血，分离血清。 分别以原核表达的衣壳蛋白与纤突蛋白为抗原，1∶2 000比例稀释的兔抗纤突蛋白血清为一抗，1∶10 000比例稀释HRP标记的羊抗兔IgG为二抗，进行Western blot 验证。

2 结果

2.1 衣壳蛋白序列测定及分子进化分析衣壳蛋白基因PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳后在凝胶自动成像系统中于2 200 bp左右可见单一高亮条带(图1)，大小与预期相符。测序结果经ORF定位显示LHC株衣壳蛋白基因全长2 115 nt，共编码704个氨基酸残基，相对分子质量约为77.6 kDa，其中第39～406位氨基酸残基为预测的衣壳蛋白N端，构成衣壳内侧的壳体蛋白，第425～665位氨基酸残基为预测的衣壳蛋白C端，为壳体外侧的纤突蛋白。

M.DL5000 DNA Marker；1.衣壳蛋白基因PCR扩增产物

衣壳蛋白氨基酸序列相似性分析显示，分离株LHC与鹅星状病毒2型(GoAstV-2)参考株相似性最高，达97.8%～99.2%，与火鸡2型星状病毒(TAstV-2)、鹅1型星状病毒(GoAstV-1)、火鸡1型星状病毒(TAstV-1)、鸭1型星状病毒(DAstV-1)、鸭2型星状病毒(DAstV-2)、鸡星状病毒(CAstV)以及禽肾炎病毒(ANV)参考株之间的相似性均低于60%。氨基酸平均遗传距离结果显示，分离株LHC与GoAstV-2参考株的平均距离为0.011，而与GoAstV-1、TAstV-1、TAstV-2、DAstV-1、DAstV-2、CAstV以及ANV参考株间的平均遗传距离均大于0.284，其中与TAstV-2间的平均遗传距离最小，为0.566(表1)。系统发育树显示，分离株LHC与GoAstV-2型参考株处于同一分支，与TAstV-2、DAstV-1距离较近，而与2014年从湖南肠炎型病鹅中分离到的鹅星状病毒[11](FLX株)及其他禽星状病毒距离较远(图2)。

图2 分离株LHC衣壳蛋白氨基酸序列系统发育树(▲表示分离株)

2.2 纤突蛋白理化特性分析Conserved Domain Search保守结构域分析结果提示衣壳蛋白第425～665位氨基酸残基为纤突蛋白，共241个氨基酸残基。ProtParam Tool理化特性分析结果显示纤突蛋白等电点为4.47，在大肠杆菌体内的半衰期为10 h，亲水平均系数为-0.417。纤突蛋白氨基酸序列多重比对结果显示LHC株与2014—2018年于湖南、广东、安徽、山东等地分离到GoAstV-2享有很高的序列以及结构相似性，氨基酸序列相似性达96.3%～99.2%，仅出现个别氨基酸位点发生点突变。均具有3个α螺旋，11个β折叠，2个无规卷曲以及9个TT转角(图3)。

图3 分离株纤突蛋白氨基酸序列与不同时间不同地区分离到的GoAstV-2参考株间的多重比对

2.3 纤突蛋白基因的扩增与重组质粒的鉴定运用引物HJ-F1/HJ-R1进行PCR扩增，产物经1%琼脂糖凝胶电泳，可见于750 bp附近有1条高亮的单一荧光条带，大小与预期相符(图4)。

M.DL5000 DNA Marker； 1.纤突蛋白基因PCR扩增产物

pET-30a-Spike重组质粒经NdeⅠ、XhoⅠ双酶切后，酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳，可见分别于700，5 000 bp附近出现2条高亮条带，大小均与预期相符。质粒测序结果进一步验证 pET-30-Spike构建成功(图5)。

M.DL15000 DNA Marker；1.pET-30a-Spike重组质粒双酶切产物；2.pET-30a空载质粒双酶切对照

2.4 纤突蛋白原核表达及鉴定如图6所示，目的蛋白得到了正确表达，于25 kDa 附近出现特异性蛋白条带，与预期大小相符，目的蛋白大部分以可溶性形式存在于上清中，少部分以包涵体形式存在沉淀中， BL21(DE3)菌株诱导对照与转化有pET-30a空载的BL21(DE3)的诱导对照均未出现与目的蛋白大小一致的蛋白条带。

M.蛋白质相对分子质量标准；1.Spike重组蛋白破碎后上清；2.Spike重组蛋白破碎后沉淀；3.BL21(DE3)菌株对照上清；4.BL21(DE3)菌株对照沉淀；5.含pET-30a空载的对照上清；6.含pET-30a空载的对照沉淀

Spike重组蛋白经His标签镍柱纯化后，如图7所示于25 kDa附近有单一的目的蛋白条带表明已得到了高纯度的Spike重组蛋白，纯化后的蛋白紫外分光光度法测得质量浓度为2.1 g/L。Spike重组蛋白Western blot结果显示，经化学发光显色在25 kDa 附近出现单一清晰目的条带，大小与预期相符。

M.蛋白质相对分子质量标准；1～4.Spike重组蛋白纯化产物

2.5 纤突蛋白多克隆抗体的鉴定用兔抗纤突蛋白的血清作为一抗分别对纤突蛋白与衣壳蛋白进行检测，免疫前血清作为阴性对照，如图8所示以兔抗纤突蛋白的血清作为一抗分别于25,78 kDa出现特异的纤突蛋白与衣壳蛋白条带，免疫前血清作为一抗的阴性抗体对照未出现蛋白条带，表明表达的纤突蛋白具有良好的免疫原性，兔抗纤突蛋白抗体能特异性识别2型鹅型状病毒衣壳蛋白，制备的兔抗多克隆抗体具有良好的反应活性。

M．预染的蛋白质相对分子质量标准；1.以1∶2 000的兔抗纤突蛋白的血清为一抗的被特异性识别的纤突蛋白(28.6 kDa)；2.以1∶2 000的兔抗纤突蛋白的血清为一抗的被特异性识别的衣壳蛋白蛋白(78 kDa)；3.以免疫前血清作为一抗未被特异性识别的纤突蛋白

3 讨论

2014年，LIU等[11]在湖南一群表现为肠炎与零星死亡的宁乡白鹅群中分离到第1株鹅星状病毒2型毒株，命名为HN1G(KY807085)。2017年以来中国山东、湖南、广东、河南、黑龙江等地雏鹅群相继暴发致死性内脏痛风，姜晓宁等[12]于表现为痛风的雏鹅中分离到鹅星状病毒2型毒株，并通过病例复制试验证实致病病原为鹅2型星状病毒。NIU等[13]从中国6省采集了4～21日龄病鹅样品共计189份，检出鹅源星状病毒2型阳性样品154份，检出率高达81.5%，提示鹅星状病毒2型已在中国雏鹅群中形成广泛传播。本试验于2018年分离获得的LHC株分子进化分析显示该分离株为鹅源星状病毒2型毒株，与2014—2018年中国不同地区分离到的2型鹅源型状病毒序列相似性达97.8%～99.2%，其中与2014年分离到HN1G株相似性为97.8%；表明2014—2018年中国不同地区间的鹅星状病毒2型毒株尚未发生明显变异，与正链RNA病毒进化速率特征相符。

星状病毒衣壳蛋白包括保守的N端和高变的C端，N端主要为衣壳壳体蛋白结构域，C端主要为纤突蛋白结构域。LEE等[14]运用杆状病毒表达系统获得鸡星状病毒重组衣壳蛋白，免疫SPF鸡可获得中和抗体。通过推导的LHC株衣壳蛋白氨基酸序列分析其保守结构域，结果显示第425～665位氨基酸残基为衣壳蛋白纤突结构，LHC株与鹅星状病毒2型参考株纤突蛋白多重比对结果显示，2014—2018年不同地区分离到的鹅星状病毒2型毒株的纤突蛋白享有很高的序列以及结构相似性，仅出现个别氨基酸位点发生点突变，表明2014—2018年中国不同地区间的鹅星状病毒2型毒株纤突蛋白尚未发生明显变异。以LHC株为模板构建鹅星状病毒2型毒株纤突蛋白原核表达质粒，并进行初步表达，重组纤突蛋白可溶性分析结果显示目的蛋白大部分以可溶性形式存在于上清中，少部分以包涵体形式存在沉淀中，与纤突蛋白亲水性预测结果基本相符。免疫新西兰白兔分离血清获得多克隆抗体，以倍比稀释的兔抗纤突蛋白的血清作为一抗对星状病毒纤突蛋白及衣壳蛋白进行Western blot检测，结果显示抗体稀释度达1∶2 000时仍可见清晰的纤突蛋白与衣壳蛋白条带，表明制备的兔抗纤突蛋白多克隆抗体具有良好的免疫原性及反应活性。

本试验运用分子生物学方法测定了分离株LHC的衣壳蛋白基因，同源性、系统发育分析及氨基酸平均遗传距离计算结果均表明分离株为鹅星状病毒2型毒株，2014—2018年中国不同地区间的鹅星状病毒2型毒株尚未发生明显变异。成功构建鹅星状病毒2型纤突蛋白原核表达质粒，并表达获得具有生物活性的重组纤突蛋白，免疫新西兰白兔获得具有反应活性的多克隆抗体，为鹅星状病毒纤突蛋白功能研究、血清学检测方法的建立以及亚单位疫苗的制备奠定理论基础。