王瑀彤，赵林博，李娜，王颖，靳书刚，李喜旺，王少华★

（河北北方学院预防兽医学重点实验室，河北张家口 075131；2.承德市畜牧技术推广站，河北承德 067400）

动物源细菌耐药性问题已经成为影响人类健康和食品安全的全球性问题， 动物源耐药菌可以通过食物链感染人体或将耐药基因转至人体病原菌而引发疾病， 对人类健康构成潜在危害[1]。 大肠杆菌属于人和动物体内的共生菌，奶牛生产过程与人类的生活密切相关。 由于在大肠杆菌病的治疗过程中抗生素的使用不当，造成了大肠杆菌耐药谱和耐药水平的不断增加[2]。牛粪污染的牛奶、 肉类和水等容易感染人类而造成耐药菌在人类间流行。 随着奶牛业规模化、现代化程度的不断提高，细菌耐药性越来越强，耐药谱越来越广，给临床治疗带来了极大困难，同时也加剧了畜牧业的经济损失[3]。

许多文章研究显示牛源大肠杆菌耐药越来越严重[4-6]。 因此笔者对张家口地区的犊牛腹泻大肠杆菌进行了分离、鉴定，并同时进行了耐药分析。 为本地区犊牛腹泻大肠杆菌的防制提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料来源

犊牛腹泻病料来自张家口地区各大型牛场，低温保存运至实验室。

1.1.2 试验试剂

尹红美兰固体培养基： LB 液体培养基：10克/升胰蛋白胨，5 克/升酵母粉，10 克/升NaCl；LB 固体培养基：10 克/升胰蛋白胨，5 克/升酵母粉，10 克/升NaCl ，1.2%～1.5%的琼脂粉；药敏片购自北京天坛生物制品股份有限公司。 DNA Marker， 细菌DNA 基因组提取试剂盒，2×Taq-Master Mix， 购自北京塞恩诺尔科技有限公司；质控菌株大肠杆菌ATCC25922 由河北北方学院预防兽医学重点试验室提供。

1.2 方法

1.2.1 细菌的分离

取肠内容物用生理盐水不同浓度稀释后3000 转/分钟离心5 分钟，取上清液分别接种于营养肉汤琼脂（LB）培养基上，37℃恒温培养16小时，无菌挑取灰白色的圆形单菌落，划线于伊红美蓝琼脂培养基， 于37℃恒温培养16～24 小时，挑取伊红美蓝琼脂培养基上生长均匀、典型的、 带金属光泽的单菌落液体LB 培养基中增殖。 最后接种于M-H 肉汤中进行纯培养，待用。

1.2.2 细菌的菌落形态和生化鉴定

将1.2.1 中分离到的细菌，进行革兰氏染色观察菌体形态，同时将细菌纯培养物接种于微量生化反应管，具体操作按照说明书。

1.2.3 16SrRNA 基因序列分析

利用Primer5 软件，根据GenBank 中已经发表的大肠杆菌的保守基因16SrRNA 设计鉴定大肠杆菌的特异性引物， 上游引物为5'－CCATTGTAGCACGTGTGT－3'， 下游引物为5'－GGGAGCAAACAGGATTAG－3'。 增菌液后提细菌基因组为模版， 进行PCR 扩增。反应条件：94℃5 分钟；94℃1 分钟；55℃1 分钟，72℃1 分钟，30 循环；最后72℃10 分钟， 取PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳检测，将PCR 产物提交于TaKaRa 公司，完成测序。 测序结果通过NCBI 的BLAST 检索系统进行序列相似性比较， 并结合菌体形态与理化特性进行细菌的最终鉴定。

1.2.4 细菌的药敏鉴定

将细菌稀释成1×108cfu/毫升，取0.1 毫升菌液均匀涂布于MH 培养基上，干燥后贴上药敏纸片，37℃培养24 小时，观察抑菌圈并测量抑菌直径。 判定结果参照CLSI 制定的药敏标准。

2 结果

2.1 细菌的分离培养结果(见图1）

图1 大肠杆菌分离培养结果

无菌采集犊牛腹泻物， 培养后结果显示在LB 培养基上长出灰白色的圆形菌落， 在尹红美兰培养基长出带有绿色金属光泽的圆形菌落，初步鉴定分离到E.coli。

2.2 分离菌株的生化鉴定结果

对分离纯化后的菌株进行生化鉴定。 结果显示：三铁塘培养基底及斜面程黄色，H2S 阴性，山梨醇发酵阴性，纤维二糖发酵阴性，胰蛋白胨肉汤靛基质阴性，M.R.试验阳性，V-P 试验阴性，柠檬酸盐阴性，赖氨酸阴性，鸟氨酸脱羧酶阳性，棉子糖发酵阳性。 符合大肠杆菌特性。

2.3PCR 鉴定琼脂糖凝胶电泳结果(见图2图3）

图2 图1 部分细菌基因组提取电泳结果

图3 图1 部分分离菌株的16S rRNA PCR 扩增结果

表2 分离大肠杆菌耐药率分析结果

被检样品分离到的细菌的PCR 结果显示，分离到的细菌样品均在480 bp 处出现了特异性片段，对PCR 扩增产物测序，与GenBank 中登陆的细菌基因组16S rRNA 测序序列进行同源性比对， 结果表明分离到的细菌菌株均为大肠杆菌。

2.4 药敏试验结果

分离的28 株大肠杆菌药物敏感性检测结果显示，28 株细菌都有不同程度的耐药，其中8重耐药有1 株细菌，7 重耐药有7 株。 其他分离菌都表现出了不同程度的耐药性。 对分离的28株大肠杆菌耐药率分析， 发现分离菌对头孢曲松耐药率达到了96.60%， 多西环素达到了82.80%， 氨苄西林和氯霉素耐药率达到了75.90%。 表明张家口地区犊牛腹泻大肠杆菌多重耐药性严重。8 种抗生素的耐药率都在58%以上。 不推荐在临床上继续使用。

3 讨论

2019 年春节前后， 实验室陆续收到犊牛腹泻相关病例病原的诊断请求。 经实验室诊断发现以大肠杆菌为主要病原。 我们随后对张家口地区相关牛场进行了走访调查， 发现犊牛腹泻普遍存在。 针对张家口地区犊牛腹泻病的现状，本研究采集了张家口部分牛场的犊牛腹泻病料，共分离出28 株大肠杆菌。 随后对其进行了药敏试验，结果发现分离菌对氨苄西林、头孢曲松、多西环素、卡那霉素、诺氟沙星、四环素、氯霉素、 多粘菌素B 等8 种药物， 耐药率超过了58%。其中有一株菌对以上8 种药物100%耐药，有7 株分离菌对7 种药产生耐药，7 重耐药菌株占到了总分离菌的25%。2 种以上耐药菌株占比高达85.7%。 以上结果提示28 种分离菌出现了严重耐药。 武瑞兵[7]从内蒙古地区分离了117 株牛肉源大肠杆菌进行了相关耐药基因的PCR 技术鉴定，结果显示117 株大肠杆菌对四环素、氨苄西林、链霉素和磺胺异恶唑的耐药率较高，分别为89%、42%、38%、和22%。 表明了此次分离的牛肉源大肠杆菌耐药非常严重。张陆在哈尔滨周边地区分离鉴定出了26 株致病性大肠杆菌，检测结果该地区主要流向致病性血清型O26、O78、O15， 所有致病性菌株都存在多重耐药现象，其中阿莫西林-棒酸、链霉素、 四环素、 复方新诺明的耐药率达到了100%[8]。 吴同垒等在2017～2018 年秦皇岛地区犊牛源腹泻大肠杆菌耐药性分析的研究中发现对林可霉素高度耐药， 耐药率为100%； 对庆大霉素和阿米卡星的耐药率为83.3%[9]。 张志强等在2020 年对河北省犊牛腹泻大肠杆菌耐药性研究发现对10 种及以上抗生素耐药的菌株占比达34%，四环素类耐药基因tetC 检出率100%[2]。 以上数据显示犊牛腹泻大肠杆菌多重耐药菌普遍存在。（基金项目：河北省教育厅青年基金项目（项目编号：QN2017305）；张家口市科技局科技计划项目（项目编号：2121027C）河北省二期农业产业技术体系奶牛创新团队建设专项资金HBCT2018120407）

表1 分离大肠杆菌药物敏感性检测结果