钟林江,杨俊莉,何勇志,李玉婷,杨安迪

(1.成都大学 药学院,四川 成都 610106;2.成都大学 食品与生物工程学院,四川 成都 610106)

0 引 言

熊胆粉来源于熊科动物黑熊的干燥胆汁，是我国传统名贵中药材[1].现代药理研究表明，熊胆粉具有清热解毒、清肝明目以及抗肿瘤等药理作用[2-3].随着熊胆类药材的临床用量逐渐增大，且与其代用品价格差异巨大，市场上的熊胆粉出现了掺入较便宜的替代品以及投料不足等问题，严重影响相应中成药质量.本文就熊胆粉的临床应用、化学成分和真伪鉴别3个方面进行综述，为熊胆粉后续质量标准的提升提供一定参考.

1 熊胆粉的临床应用

目前，已有153种上市中成药含有熊胆粉，如熊胆胶囊、熊胆痔灵栓与痰热清注射液等，其中很多药已被列为国家中药保护品种.通过检索《中国药典》《新编中成药合理应用手册》以及《新编国家中成药》，剔除其中重复记录，有45种含熊胆粉的中成药，其中处方药有20种，非处方药A类有25种.内科病症(19 种) 的熊胆粉中成药在临床应用最为广泛，如治疗咳嗽、发热、肝病、高血压与心绞痛等；其次为眼科病症(11种),以外用为主，如治疗沙眼、麦粒肿、急性结膜炎与睑缘炎等；再其次为外科病症(7种)，如治疗疮疡热痛、胆结石与食管癌等；再次为耳鼻喉科病症(6种)，如治疗急慢性咽喉炎与口舌生疮；其后依次为痔疮(4种)、消化不良(2种)及妇科疾病(2种).常用含熊胆粉中成药功效见表1[4-6].

表1 常用含熊胆粉中成药的功效

2 熊胆粉的化学成分

动物胆的药效主要与胆汁中的化学成分有关.动物胆汁的化学成分主要包括胆酸类、胆固醇、色素类、磷脂、氨基酸、无机盐以及微量元素等[7-8].其中，胆汁酸是其主要的活性成分，以去氧胆酸(DCA)为主,不同动物胆汁中主要活性成分见表2，表2中，牛磺猪胆酸(THCA)、猪胆酸(HCA)、牛磺去氧胆酸(TDCA)、牛磺鹅去氧胆酸(TCDCA)、牛磺石胆酸(TLCA)、甘氨胆酸(GCA)、牛磺猪去氧胆酸(THDCA)、甘氨去氧胆酸(GDCA)、熊去氧胆酸(UDCA)、牛磺胆酸(TCA)、猪去氧胆酸(HDCA)、胆酸(CA)、牛磺熊去氧胆酸(TUDCA)、去氧胆酸(DCA)、鹅去氧胆酸(CDCA).

表2 15种动物胆汁中主要活性成分

由表2可知，通过对15种动物胆汁中主要活性成分进行整理，可见其具有一定相似性，其测定方法均以熊去氧胆酸(UDCA)一种成分作为测定指标，检测指标单一，难以鉴别熊胆样品确切来源.

3 熊胆粉的鉴别

3.1 DNA鉴别

熊胆粉的传统鉴别方法主要有手搓、水试、口尝以及火烧等，但感官指标常因操作者的经验不同而存在较大差异，难以达到标准化.何永盛等[9]采用TaqMan实时荧光PCR法，检测黑熊和棕熊的COI的基因，并根据基因设计出特异性检测引物和探针，在此基础上建立了一种快速鉴别熊胆粉生物来源的检测方法.通过两个引物的结合，完成了胆粉类药材及其正伪掺杂品的鉴别.许亚春等[10]将DNA 条形码技术应用于熊胆粉及其混伪品的鉴定研究，对收集的熊胆粉样品进行DNA 提取以及PCR扩增双向测序，结果显示在COI序列建立的NJ树中，黑熊、棕熊及混伪品各聚为一支，且可以较好地区分开.田娜等[11]基于STR分型原理建立了一种简单、快捷且可用于动物胆粉类药材及其掺伪品的通用DNA指纹图谱鉴别方法，并收集了猪、熊、鱼、鸡、鸭、牛、羊、鹅与蛇等胆粉样本，使用筛选获得的鉴别引物扩增，并进行STR分型获得DNA指纹图谱.根据各物种的STR指纹图谱差异，可进行物种鉴别.作为一种安全便捷可靠的物种鉴定技术，DNA条形码指纹图谱上可以同时反映正伪品的信息，可作为市售熊胆粉真伪鉴别的一种辅助手段.同时，该研究建立的DNA条形码鉴别方法，同样也可用于其他动物药材的真伪鉴别和掺混品的检出.

3.2 显微鉴别

显微镜可用于观察药材内部细胞形态及其组织构造，从而大致判定其质地和成分.张丽华等[12]分别取熊胆、猪胆、羊胆和牛胆的粉末于载玻片上，分别滴加甲苯和乙二醇，进行显微观察.结果显示，熊胆粉的显微特征与猪胆粉、羊胆粉及牛胆粉有一定的区别，可用于提供一定鉴别依据.李炎桂等[13]使用甲苯作为溶媒装片，分别对貉胆粉、熊胆粉进行显微观察，结果显示，熊胆粉与豹胆粉也有一定差异.

3.3 荧光鉴别

谭文敏[14]取熊胆粉与兔胆粉末，置于紫外光灯下观察，其中熊胆粉可观察到黄白色荧光，而兔胆粉未观察到明显荧光现象.李炎桂等[13]发现熊胆粉在紫外光灯下观察到黄白色荧光，而貉胆粉则可观察到明亮黄绿色荧光.但杨令家等[15]分别置熊胆粉末和狗胆粉末于紫外光灯(波长365nm)下观察，二者在紫外条件下均有黄白色荧光，结果表明，在紫外条件下显示黄白色荧光的不止熊胆粉一种胆粉，故荧光鉴别不能作为熊胆粉鉴别依据.

3.4 薄层鉴别

何柯等[16]建立了熊胆粉的薄层鉴别方法.取牛磺熊去氧胆酸对照品，加甲醇制成对照品溶液，以乙酸乙酯—正丁醇—冰乙酸—水(40∶30∶15∶15)为展开剂，磷钼酸溶液为显色剂，供试品色谱中，与对照品色谱相应位置上，存在相同颜色的斑点.缺熊胆粉的阴性溶液色谱在相应位置处无对应的斑点.李炎桂等[13]对兔胆粉、猪胆粉、豹胆粉与熊胆粉进行了薄层鉴别，均以异辛烷—冰醋酸—异戊醚—正丁醇—水(10∶5∶5∶3∶1)为展开剂，但其展开显色后，各动物胆粉间差异较小，故薄层鉴别法不能为熊胆粉的鉴别提供可靠依据.

3.5 红外光谱鉴别

近年来,红外光谱鉴别逐渐成为中药质量鉴定的一种重要手段.李政等[17]将天然熊胆粉、人工熊胆粉及牛磺熊去氧胆酸于傅里叶变换红外光谱仪上同法绘制红外吸收光谱图.结果显示，3者在1 700～700 cm-1范围存在特征性区别,为鉴别天然熊胆粉与人工熊胆粉提供了参考.鄢海燕等[18]运用红外光谱来鉴别熊胆粉、猪胆粉、牛胆粉与鸡胆粉，结果显示，该方法可以鉴别熊胆粉、牛胆粉与猪胆粉，但不能准确区分熊胆粉与鸡胆粉.因其鸡胆粉与熊胆粉的红外吸收光谱图基本一致，熊胆粉的3个主要红外吸收特征鸡胆粉图谱中均有.

3.6 近红外光谱鉴别

随着仪器分析技术的发展，近年来熊胆粉质量控制及真伪鉴别技术也出现了快速分析的方法.李文龙等[19-20]采用近红外漫反射光谱法建立了一种熊胆粉提取物中熊去氧胆酸和鹅去氧胆酸定量预测模型，鉴别了熊胆粉的真伪.并对其掺伪品的掺入比例做了定量分析，对采集到的结果进行主成分分析，结果表明，熊胆粉及其掺伪品之间存在明显界限，不同来源地的熊胆粉之间存在着一定的差异.程志伟[21]采用近红外光谱分析技术，建立了熊胆粉水解过程中4种胆汁酸(牛磺熊去氧胆酸、牛磺鹅去氧胆酸、熊去氧胆酸以及鹅去氧胆酸)含量的快速测定方法，适用于大规模与批量生产的质量控制，同时将近红外光谱分析技术与移动窗标准偏差法相结合，提出了一种快速有效的熊胆粉水解过程终点判断方法，为其他动物药的水解过程质量控制提供了新思路.与传统的分析技术相比，近红外光谱技术具有高效、在线检测、无损分析与多通道数据传输等优点，对于实现中药生产智能化以及规范化有着重大意义.

3.7 氨基酸和微量元素含量鉴别

氨基酸和微量元素是与机体生命活动息息相关的重要物质，其中重金属元素为中药进出口检测的重要指标之一.因此，对熊胆粉中氨基酸和微量元素的含量进行测定，可用于熊胆粉的鉴别.李菲[22]用氨基酸分析仪和原子分光光度计等仪器分别测定熊胆粉、鹅胆粉、鸡胆粉与鸭胆粉中氨基酸及微量元素的含量，发现4种胆粉中游离氨基酸的含量均较低，水解氨基酸的含量从小到大依次为熊胆粉、鸡胆粉、 鹅胆粉与鸭胆粉，4种胆粉均含有18 种中无机元素，其中磷、钾、钙、镁与钠的含有量较高，且熊胆粉中含量低于其他胆粉.王杰等[23]利用液相色谱与质谱联用技术测定不同来源地(四川、云南与黑龙江)熊胆粉的胆汁酸和氨基酸，并利用电感耦合等离子体质谱仪测定其微量元素.结果表明，不同来源熊胆粉中氨基酸与微量元素含量也存在着一定的差异，为熊胆粉的鉴别提供了一定的科学依据.

3.8 特征图谱鉴别

熊胆粉现行的质量标准大多采用紫外检测器测定其胆汁酸含量，但其胆甾烷结构仅有极其微弱的紫外末端吸收，灵敏度差[24-25].蒸发光散射检测器是目前广泛应用的胆汁酸成分检测器，弥补了紫外检测器基线漂移与灵敏度差等一系列问题[26-28]，但蒸发光散射检测器在精密度等方面仍具有一定局限性[29-31].由于熊胆粉成分复杂，单采用高效液相色谱法难以将其大多数成分洗脱出来,目前未见有相关研究仅利用高效液相色谱法建立熊胆粉所有成分的特征指纹图谱.简龙海等[32]运用高效液相色谱法只针对痰热清注射液中熊胆粉部分的指纹图谱进行了测定，并定量测定了熊去氧胆酸与鹅去氧胆酸.张怡欣等[33]首次采用超高效液相色谱串联电喷雾式检测器新技术，对熊胆粉中胆汁酸成分进行了分析，建立了熊胆粉的特征指纹图谱，并对不同来源熊胆粉进行了相似度评价以及差异性化学成分分析，解决了熊胆粉现行质量控制模式存在的胆汁酸类化合物信息不足、检测困难以及耗时长等问题，为熊胆粉的鉴别提供了新的思路和方法.

4 结 语

中药材的研究热点主要集中在化学成分分析及其药理作用研究方面[34]，大部分中药材的鉴定方法并不完善，还有待进一步研究.熊胆粉的主要活性成分熊去氧胆酸可通过人工合成途径获得，一定程度上为其替代品提供了可能性，但有研究表明，熊胆粉的功效在于其熊去氧胆酸与其他多种成分的协同作用，人工合成熊去氧胆酸难以完全替代其疗效.为确保熊胆粉中成药的功效，有必要建立鉴别熊胆粉样品确切来源的检测方法.目前，熊胆粉常用的鉴别方法为性状鉴别、显微鉴别及薄层鉴别等，存在一定主观因素,不能满足现代中成药的生产需求，如采用薄层鉴别法比较其成分差异，具体这种成分的差异，是否会导致两者在其药理作用的差异，有待进一步探讨.

熊胆粉与其他动物胆粉具有相似的化学组成，但其形成机理和环境不同，在一定程度上必然存在差异，可采用超高效液相色谱联合飞行时间串联质谱技术并结合多元统计分析软件分析熊胆粉及其他胆粉的化学成分[35-36]，从而发现其专属性特征成分，准确鉴别并控制其质量，全面提升熊胆粉中成药的质量标准.后期可借助光谱、气/液色谱、质谱以及相关联用技术，研究传统名贵中药材的特征图谱.同时，可借助DNA条形码、PCR 扩增及谱—效等分子生物学技术，开展其特异性成分的定性鉴别及定量研究，以提高其质量标准.