霍子奇，张贺惟，韩文超，柏 爽，闫 磊

（长春祈健生物制品有限公司，吉林 长春130012）

生物制药行业的发展与生产技术有直接关联，在多种生物制药技术的辅助下，提升中国生物制药的水平。真空冷冻干燥技术在水痘减毒活疫苗中的运用可提升其使用效果，延长保存时间，有效提升冻干工艺使用质量，有利于制药行业的发展。

1 冻干的原理

水可以分成三相，分别是气态、液态与固态，结合热力学有关知识理论能够知道，压力的降低可以促使水的冰点与沸点之间相互重合。然后采用加热的处理方法，冰便会从液态直接经过升华过程变为气态。冻干过程的原理便是应用低压低温状态下水三相的具体变化，首先针对需要进行干燥处理的物料予以降温冻结处理，令物料中以液态形式存在的水可以变为以固态存在的冰，之后在真空的状况下针对物料实施相应的加热处理，这样冰会直接升华变为水蒸气而从中除去，便可以获取低温脱水相应的干燥制品。一个比较典型的冷冻干燥工艺过程，通常可以分成恒压降温、恒温降压和恒温升温几个热力学过程。

2 水痘减毒活疫苗在冻干工艺上存在的问题

近几年生物制药技术快速发展，不断产生新的多肽蛋白类药物，可运用于临床中的蛋白酶、疫苗、多肽与脂质体等成为研发重点。而这些药物有个共性问题，就是都属于热敏性药品，为了防止热敏性药物在生产过程中温度过高而对药物产生不利的影响，同时也便于药物的运输及储存，目前使用冷冻干燥法将其制备成固态的药品[1]，经历几十年的发展，药物冷冻干燥技术已经有了很大的进步，但仍然存在问题[2]，例如在冷冻干燥的时候会产生多种干燥与冻结应力，因此也会令药物产生变形和外观的完整性受损。另外冻干法自身也有干燥时间长、速率低于能源损耗高的情况。借此为了提升药物的稳定性，需加强对冻干工艺的优化。除此之外，水痘减毒活疫苗为冻干注射剂，滴度不好保持，且在自由细胞悬浮液中不稳定，以冻干工艺，进行大规模生产时候若不能科学控制，都会导致水痘减毒活疫苗中滴度、水分、真空度、外观（萎缩：整体缩小、下沉、缺肉）等多种指标低或者不合格，因此在水痘减毒活疫苗生产中，使用真空冷冻干燥技术意义重大。

3 冻干参数的设计

冻干参数的设计会受到众多方面因素的影响，由于文章篇幅比较有限，这里简要列举其中一些影响因素。

3.1 冻结方式的影响

关于冻结方式，可以分成两种不同类型，分别是全域过冷结晶和定向结晶。采用不相同的冻结方式，其形成冰晶的形态及大小也会存在一定的差异，同时也会导致制剂相应的干燥速度与冻干质量受到一定影响，因此应用良好的冻结方式是极为关键的。全域过冷结晶指的是所有的溶液在处在相同或是相近的过冷温度状态下实施冻结处理，根据冻结的实际速率分成快速冻结与慢速冻结两种不同方式。全域过冷结晶中，冰晶成核温度与冻结速率是其中比较主要的参数。定向结晶指的小部分溶液在过冷的状况下实施冻结处理的一种方式。一般情况下，应用定向结晶方法的冻结药液相应的干燥速度相较于全域过冷结晶明显更快。然而不管是采用何种冻结方法，药液都需要保证部分或是全部地完成玻璃化冻结，以确保相应的药性。

3.2 冻结温度的影响

对于冻结温度，其结合采用预冻方法的不同和样品性质的不同，其结果也不尽相同。通常来讲，冻结温度和药液的共晶之间存在着密切的关联性，安全的冻结温度需要小于共晶点约10℃。如果冻结温度过低，那么便会导致能源浪费情况的出现。

3.3 冻结时间的影响

设定合理的冻结时间能够确保药液在完成干燥处理以前被冻牢，这样可以避免由于抽真空出现喷瓶的情况。冻结的时间需要结合传热介质、板层面积等方面加以定夺，通常在1～3 h内会完全性冻结。

3.4 退火的影响

退火是将冻结疫苗进行升温处理，使其接近相应的共熔点，且进行一定时间的保温，之后温度降低至冻结温度的处理环节。在升华前增加相应退火处理工艺的原因如下：首先，是因为退火温度超过冻结样品玻璃化转化温度Tg，这样更加利于溶液中含有的结晶成分和浓缩液中没有冻结的水进行完全性的结晶，加强了结晶这一过程；其次，提升非晶相最大冻结浓缩液相应的玻璃转化温度Tg，这样可以具有更高的稳定性；最后，退火环节中的相行为和重结晶，能够减低由于成核温度差异所造成的冰晶在尺寸上的差异，实现对冰晶形态和大小分布情况的有效调节，提升相应的干燥效率。要想使得退火工艺相应的目的得到良好实现，实际操作中需要关注加热的速率，退火的时间和退火的温度等相关参数。因为当前对于冻干中的退火机理认识依然不是十分清晰，所以，退火工艺相关参数的选择也缺少一定的根据。

3.5 升化温度的影响

关于升华温度，不可以高于已干层相应的崩解温度，同时也不可以高于冻结层相应的共熔点温度。若是升华温度远远小于共熔点温度，那么升华的速度便会显著下降，相应的时间也会有所延长。若是高出共熔点相应的温度，那么物料便会出现熔化的情况，在干燥过后物料可能会产生溶解困难的问题，且会出现颜色加深等情况。所以在升华阶段物料的温度应尽可能与共熔点温度接近，但不可以高于这一温度。与共熔点温度越是相近，相应生升华的速度也就越快。升华干燥这一阶段，冻干箱的搁板是物料热量相应的来源，通常依赖于上搁板的热辐射与下搁板的热传导两种不同方式予以热量的提供。所以，搁板的温度需要保持在相对合理的范围中，通常结合升华温度、冷阱温度和冻干箱中的压强几方面因素加以确立。

3.6 升华速度的设计

升华速度会对冻干工艺相应的时间造成一定的影响，对应的大小与提供给升华界面的热量及其由升华界面经过干燥层而逸出水蒸气的快慢之间存在一定的关联。在升华干燥时，如果真空度不足或是供热不够有可能会造成成品水分的升华不是十分完全，出现含水量较高的情况。过快的升华速度极为可能导致冻干层相应的结构受到一定的破坏，情况比较严重时，还会导致喷瓶问题的产生，促使冻干失败。进行冷冻干燥处理旨在可以获取合格且具有一定均一性的产品，所以对于升华速度的控制需要将此作为标准。升华干燥相应的理想状态是确保药品质量的重要基础，应尽量提升升华的速度。对于提升升华速度的措施可以归结如下：尽量提升升华中相应的温度，减小冷阱温度，变更干燥室中的压力，提升已干层所具有的导热性，减少已干层相应的厚度。通常来讲，性能比较良好的冷冻干燥剂对应的升华时间也比较短。

3.7 解析干燥阶段的影响

冷阱温度、物料温度、干燥时间和箱内压强是解析干燥环节比较常见的相关控制参数。这一环节需要将产品中存在的结合水除去，所以搁板应提供充足的热量，用以对水的结合力加以克服，让产品温度升高到其最高的准许温度，并保持几个小时的时间直至冻干过程结束。物料的最高准许温度应结合物料的品种加以定夺，通常需要保持在20～40℃范围内。如果物料温度超出相应的极限值，疫苗中的相关有效成分便会出现变质的情况，导致疫苗效果的下降。要想确保结合水能够顺利从中除去，冻干箱中需要保持高真空，确保物料内外可以形成比较大蒸汽压，这样可以有效提高相应的传质效率。另外，在接下来的干燥期间，需要尽量减小冷阱温度。升华干燥需要的时间主要取决于水分的残留量，针对包含热敏性成分的疫苗，为了避免其中含有的成分发生变性或是失去活性的情况，高温的时间不可过长。

4 真空冷冻干燥技术在水痘减毒活疫苗中的运用

4.1 选择冻干机性能

冷冻干燥（又称“真空冷冻干燥”或“升华干燥”，简称“冻干”）是将富含水的物料利用升华的原理在真空条件下使物料脱水的一种干燥技术[3]，实现冷冻干燥技术的设备称为冻干机，而冻干机性能的选择是真空冷冻干燥技术的关键。在使用该技术实施水痘减毒活疫苗的生产与储存时，需依据疫苗的生产工艺规程（关键工艺参数和关键质量属性）与生产需求，分析冻干机的性能，并在规范规定的辅助下，选择最适合的冻干机设备。对于冻干机性能的选择需要注意：①冻干机的规格、容量、隔板尺寸等需与实际生产量相符。在此使用上海东富龙科技有限公司生产的真空冷冻干燥系统——LYO-20型真空冷冻干燥机。②冻干机隔板正反面都需平整，保障板温的均匀[4]。③保证冷凝器的温度在4 h就可降到一定温度，即不超过40℃。④箱体中的真空度需保持在45 min内达到2 Pa以下，为水痘减毒活疫苗后期干燥环节提供对应的环境，同时避免蒸汽冷凝管与冻干箱体产生真空泄漏的情况，则在使用前要先对外压部件进行泄漏量测试，避免发生药品污染。

4.2 技术运用过程

4.2.1 预冻阶段

预冻阶段是冻干机真空冷冻干燥过程的一个重要环节，预冻过程是一个液相变为固相的过程。预冻的方法基本有两种，一种是在冻干机干燥室内直接进行预冻的箱内法，另外一种是箱外法，配套超低温冰箱或者低温冷库系统进行低温冷冻。

箱内法是在冻干箱内预冻，盛装疫苗的容器直接放置在冻干箱的板层上冷冻干燥，直至出箱，不需要转移，比较方便；而箱外法一般是大型冻干机生产，提高冻干生产效率，直接在低温冷库进行预冻，然后再移入大型冻干机干燥室内进行真空冷冻干燥。根据水痘减毒活疫苗的生产工艺及产品特点，选用箱内法进行冻干生产。而影响疫苗冻干生产预冻阶段的两个重要参数是预冻速度和预冻温度。

一方面，预冻速度。预冻过程在较大程度上决定水痘减毒活疫苗的质量，在此使用预冻方法进行实验[5]。实验目的：考察速冻法对水痘减毒活疫苗外观与活性的影响。实验方法：取一半疫苗产品实施速冻实验，先用冻干箱预冷，然后在装箱开始就保证容器内的温度在﹣40℃以下，对冻干工艺曲线与冻干后外观、病毒滴度等要素进行考察，实施对比。速冻法预冻速度对冻干工艺曲线、冻干后外观病毒滴度等要素分析如表1所示。

表1 速冻法预冻速度对冻干工艺曲线、冻干后外观病毒滴度等要素分析

另一方面，预冻温度。水痘减毒活疫苗的预冻最低温度取决于其共熔点温度，所以预冻的最低温度需低于本产品的共熔点温度。以固定产品为目的，进行真空中的升华。若水痘减毒活疫苗没有冻实，抽真空时产品就会溢出；若预冻温度过低，不但会影响水痘减毒活疫苗的存活率，还会浪费资源。结合水痘减毒活疫苗形态变化，在实验中使用慢冻法，这样更好观察产品温度与形态变化的关系，反复确认后，建议水痘减毒活疫苗使用﹣45℃的预冻温度。

4.2.2 升华阶段

升华阶段也称第一阶段，是真空冷冻干燥的关键阶段，大部分的水在这一阶段被升华。此阶段是将冻结后的疫苗置于密封的真空容器中加热，其冰晶就会升华成水蒸气逸出，使疫苗确保在没有水的情况下完成干燥任务。

水痘减毒活疫苗中水升华驱动力为冷阱间与药物的温度差，基于药物温度受加热形式的限制且要地域共熔温度，因此冷阱温度要低。

以控制温度与控制时间分别为30℃与5 h、33℃与4 h、35℃与3 h进行对比分析[6]，考察水痘减毒活疫苗在冷冻干燥过程中的热敏感程度，如表2所示。虽然30℃与35℃都能缩短水痘减毒活疫苗冻干期，但是对病毒滴度的指标有一定的影响，最佳温控温度与时间为30℃与5 h[7]。

表2 水痘减毒活疫苗控温温度筛选结果

4.2.3 解析干燥阶段

解析干燥阶段也称第二阶段干燥。水痘减毒活疫苗在升华阶段干燥结束水分升华为水蒸气后，在其内部产生大量空隙，可能还残留水分，吸附在干燥物质的毛细管壁和极性基团上，若不及时对其进行处理，会影响其储存效果，因此要对水痘减毒活疫苗进行解析干燥处理，以确保水痘减毒活疫苗的含水量控制在1.8%以内。

随着中国生物制药技术的发展，真空冷冻干燥技术作用愈加提升，其在水痘减毒活疫苗中的运用，不但可突破在生产过程中的多种局限，还能延长保存时间与治疗效果[8]。经过上述介绍，真空冷冻干燥技术在水痘减毒活疫苗中的运用，经过对预冻阶段、升华阶段与解析干燥阶段进行详细分析，为生物制药产业的发展与推广提供技术支持。