杨 斌 ， 黄红亮 ， 方倪然 ， 陈瑞爱,

[1. 华农(肇庆)生物产业技术研究院有限公司 ， 广东 云浮 527300 ； 2.广东温氏大华农生物科技有限公司 ， 广东 新兴 527400 ]

猪圆环病毒(Porcine circovirus)属于圆环病毒科圆环病毒属,是一种无囊膜、共价闭合的单股环状DNA病毒，是目前已知最小的动物DNA病毒，主要由PCV1、PCV2和PCV3组成[1]。PCV3基因组全长约2.0kb,感染后临床上主要表现为断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)、猪呼吸道综合征(PRDC)、皮炎和肾病综合征(PDNS)、繁殖障碍等疾病[2-3]。自2015年猪圆环病毒3型(PCV3)在美国首次被发现以来，已经在北美洲、亚洲、欧洲三大洲多个国家检出患病猪只的组织中含有PCV3[3-7]。目前，PCV3已经成为造养猪业损失的重要病因之一，并且还有加剧的趋势。为了进一步防控PCV3的蔓延，如何能够准确及时地对患病猪只进行诊断变得尤为重要。实时荧光定量PCR技术是近几年发展起来的一种新的核酸定量检测技术。与普通PCR相比，实时荧光定量PCR技术不仅具有操作灵活、速度快、灵敏度高、特异性强等优点，而且还能够准确定量，实时监控PCR过程，因此目前其已经越来越多应用在猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒2型病毒(PCV2)等猪病毒分子的检测[8]。

本试验通过实时荧光定量PCR技术建立了一套针对PCV3的有效检测方法，并且在临床上加以应用，本方法的建立为临床上快速诊断PCV3并及时防控提供了科学依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料 PCV3阳性样品由广东温氏研究院惠赠，本试验所需要的其他猪病阳性样品如CSFV、PRRSV、PCV2、PRV等均由本实验保存。

1.2 主要试剂 DNA Marker DL2 000、rTaq聚合酶预混液、胶回收试剂盒、JM109大肠杆菌细胞、T4 DNA连接酶、TaqDNA聚合酶、逆转录试剂盒、质粒抽提试剂盒，均购自宝生物工程(大连)有限公司；G-Red核酸染料，购自北京百泰克生物技术有限公司；DNA抽提试剂盒，购自康宁生命科学(吴江)有限公司；LB培养基，购自广东环凯微生物科技有限公司；琼脂糖，购自上海翊圣生物科技有限公司；TAE缓冲液，购自上海百赛生物技术有限公司。

1.3 荧光定量PCR方法的建立

1.3.1 探针和引物的设计 根据猪圆环病毒3型PCV3-Hebei-LY_2015毒株(GenBank登录号：MF318451.1)应用Primer Premier 5.0软件设计1对引物和探针，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物和探针序列见表1。

表1 引物探针序列及扩增片段大小Table 1 Primer and probe sequence and amplified fragment size

1.3.2 标准品的制备 将目的片段连接pMD18-T载体，重组质粒并转化到大肠杆菌，培养含有pMD18-T-PCV3的目的菌株并提取质粒，将构建的质粒经测序鉴定无误后用紫外分光光度计测定质粒OD值，置于-20 ℃保存。

1.3.3 荧光定量PCR反应体系及条件的优化 对循环数、探针浓度、退火温度、模板量进行摸索以获得最佳的反应条件。

1.3.4 标准曲线的建立 经过测定和计算，提取的质粒拷贝数为1.18×1011copies/μL。将标准品稀释1 000倍后，继续做10倍系列稀释，与之相对应的模板浓度分别是1.18×108、1.18×107、1.18×106、1.18×105、1.18×104copies/μL和1.18×103copies/μL。以起始模板数作X轴，Ct值为Y轴做回归曲线，建立PCV3的标准曲线。

1.3.5 敏感性试验 为了检验TaqMan荧光定量PCR检测方法的敏感性，模板质粒浓度为1.18×108、1.18×107、1.18×106、1.18×105、1.18×104、1.18×103、1.18×102copies/μL和1.18×101copies/μL，每个浓度做3个重复孔，进行荧光定量PCR检测。

1.3.6 特异性试验 提取PCV2、PRV的DNA以及PRRSV和CSFV的RNA(经反转录为cDNA)，并且按照上述方法进行荧光定量PCR检测，同时设置空白对照。

1.3.7 重复性试验 为了检验TaqMan荧光定量PCR检测方法的可重复性和稳定性，本试验选取浓度为108、107、106、105、104copies/μL和103copies/μL的标准质粒为模板，每个浓度的标准质粒设3个重复孔，进行组内重复试验；同时每个浓度的标准质粒选取不同时间分别做3次独立的重复性检测作为组间重复性检测。统计组内重复性试验和组间重复性试验的平均值、标准差和变异系数(%)，以此来评价该检测方法的重复性和稳定性。

1.3.8 PCV3荧光定量PCR方法临床检测 选取30份疑似PCV3感染的仔猪组织样品用PCV3常规PCR检测方法和本试验建立的TaqMan荧光定量PCR检测方法进行同时检测，统计PCV3的阳性样品数量，比较2种检测方法的敏感性。

2 结果

2.1 标准品的建立 将特异性引物经PCR扩增所获得的约179 bp的目的条带回收，连接pMD-18T载体后，转化大肠杆菌JM109，平板培养后经PCR挑取阳性菌株，测序后与GenBank登录的PCV3序列比对，同源性为98%～100%，表明该序列确为PCV3序列。取阳性菌株培养提取质粒后，检测其浓度并计算拷贝数为1.18×1011copies/μL。将质粒作为阳性标准品，置于-20 ℃备用。

2.2 荧光定量PCR反应条件的优化 对荧光定量PCR的循环数、探针浓度、退火温度、模板量进行摸索得到以下最佳反应体系(20 μL)：TaqMan Fast qPCR Master Mix 10 μL，PCV3-FI 0.4 μL，PCV3-R1 0.4 μL PCV3-Pn 0.4 μL，ddH2O 7.8 μL，Template(DNA)1.0 μL。最佳反应程序：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性10 s，57 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，45个循环。

2.3 标准曲线的建立 将构建好的质粒进行10倍系列稀释，共6个点，每个点做3次重复，通过预试验选取合适标准品用于制备标准曲线。结果显示：6个浓度标准品均具有重复性和单一性。根据扩增获得的各梯度的Ct值，计算并绘制标准曲线(图1)，得到标准曲线方程Y=-3.28X+41.605，斜率=-3.28，扩增效率：E=10-1/斜率-1=10-1/-3.28-1=101.763%，相关系数：R2=0.998，截距=41.605。

图1 PCV3 实时荧光定量PCR标准曲线图Fig.1 PCV3 real-time fluorescence quantitative PCR standard curve

2.4 敏感性试验 将标准品从1.18×109copies/μL开始10倍系列稀释，稀释到11.8 copies/μL，用已经建立的荧光定量PCR检测方法检测仍然能够检出(图2)。说明该方法具有良好的敏感性。

图2 10倍系列稀释样品扩增曲线Fig.2 Amplification curve of 10-fold serial dilution samples

2.5 特异性试验 提取的PCV2、PRV的DNA以及PRRSV和CSFV的RNA(经过反转录为cDNA)，按照上述方法进行荧光定量PCR检测，结果显示，仅PCV的样品可扩增出1条标准的S型曲线(图3)，而其他4种病毒均不能扩增出S型曲线，因此，确定PCV2、PRV、PRRSV和CSFV均为阴性，表明该方法特异性好。

图3 PCV3特异性曲线 Fig.3 PCV3 specific curve

2.6 重复性试验 经过计算，组内重复性试验的标准差在0.07～0.24，变异系数在0.35～1.10(表2)；组间重复性试验的标准差在0.12～0.34，变异系数在0.63～1.50(表3)。两者变异系数均小于2%，试验结果显示，该TaqMan荧光定量PCR检测方法具有极高的稳定性和可重复性。

表2 组内重复性试验Table 2 Intra group repeatability test

表3 组间重复性试验Table 3 Inter group repeatability test

2.7 临床检测 用PCV3常规PCR检测方法和TaqMan荧光定量PCR检测方法对30份疑似PCV3感染的仔猪心脏、肝脏、肺脏、淋巴结、扁桃体等组织样品进行同时检测，结果表明：常规PCR检测方法共检出17份PCV3阳性样品，TaqMan荧光定量PCR检测方法检出21份PCV3阳性样品，经研究发现，其中4份样品中PCV3的病毒含量低于常规PCR检测方法检测浓度下限，因此说明TaqMan荧光定量PCR具有更高的灵敏性。

3 讨论

2015年6月，美国堪萨斯州立大学Palinski等研究人员从北卡罗来纳州的一个暴发皮炎和肾病综合征(PDNS)的猪场中检测到一种新型猪圆环病毒，并且通过宏基因组测序和遗传进化分析将其命名为圆环病毒3型[2]。随后分别在韩国、巴西、意大利、泰国的患病猪只中检测到PCV3[4,6-7,9]。2017年，Ku等首次对我国11个省市的PCV3流行情况进行调查，结果显示：农场阳性率为68.6%(24/35)，样本阳性率为34.7%(77/222)，PCV2和PCV3的混合感染率为15.8%(35/222)[10]；2018年，赵宇等对河南地区的152份病料进行检测，其中有46份病料为PCV2和PCV3混合感染，混合感染率为30.3%，还有一部分病料中检测到了PRRSV、PEDV、PRV存在[11]。由此说明目前PCV3在我国流行已经呈常态化、复杂化且有逐年递增的趋势，因此如何及时、准确的检测PCV3，成为预防和控制PCV3流行蔓延的关键。

实时荧光定量PCR技术是近几年来发展起来的一种新的核酸定量检测技术，实时荧光定量PCR技术实现PCR从定性到定量的飞跃。实时荧光定量PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法，这种方法不仅具有特异性强，自动化程度高，而且还能够有效防止污染，准确定量，实时监控，目前临床上多采用SYBR Green法检测PCV3[12]，但是由于染料能够与任意DNA双链结合发光，所以很容易与非特异性双链DNA结合，产生假阳性，导致特异性较差[8]。实时荧光定量技术主要分为SYBR Green法和TaqMan探针法。由于SYBR Green法价格相对便宜并且实现了全闭管式操作，减少了假阳性现象的出现，同时探针技术的高特异性和光谱技术的高敏感性既克服了常规PCR技术只能实现定性检测的不足，又解决了SYBR Green法特异性不强等缺点，更加适应临床检测[13-14]。

本试验首次通过在PCV3 Cap蛋白上设计引物增强了检测的准确性，该检测方法实现了全闭管式操作，减少了假阳性现象的出现，同时TaqMan探针技术的高特异性和光谱技术的高敏感性既克服了常规PCR技术只能实现定性检测的不足，又解决了SYBR Green法特异性不强等缺点，更加适应临床检测；该方法灵敏度高，特异性和重复性较好，最低检测下限为11.8 copies/μL，经与目前已发表的猪圆环病毒3型Real-time PCR等检测方法进行比较发现，该方法具有特异性强、灵敏度高、重复性好等优势，该方法的建立为PCV3的早期快速检测及其流行病学调查，以及预防和控制我国PCV3的流行提供了快速、简便和可靠的技术工具。