黄 晶，张艺晴，徐 瑶，邓礼易，吴涛峰，杨大诚，高伟健，蓝银涛，周梦宇，邱 婷，王俐梅，张 建*

（1.广州医科大学基础医学院生物医学工程系，广州 511436；2.广东莱恩医药研究院有限公司，广东省药物非临床评价研究企业重点实验室，国家中药现代化工程技术研究中心中药非临床评价分中心，广州 510990）

视网膜母细胞瘤（retinoblastoma，RB）是婴幼儿高发的眼内恶性肿瘤［1］，其最常见的发病位置是玻璃体内。RB病的致死率和致盲率高，更严重的是，近年来RB的发病率有明显的上升趋向［2］。近五年，发达国家的视网膜母细胞瘤患儿的生存率已经达到90%以上，但是我国的RB患儿的病死率依旧很高［3］，患儿的视力健康以及生命安全都已拉响了警钟。RB有着特有的遗传规律、较高的退变率和多方向的分化潜力［4］，其相关研究已成为医学界的热点之一。由于活检时肿瘤转移的风险会大大提升，所以RB的诊断一般不借助于组织病理切片［5］。同时，电离辐射可以增加携带RB1突变基因的患者诱发第二种原发性癌症的概率［6］，因此临床也通常会尽量避免使用电子计算机断层扫描。磁共振成像可通过评估视神经的侵袭进而推测RB的存在［7-8］，但受限于分辨率，其很难直接可视化眼内的RB细胞。现阶段眼科医生仍然主要通过检眼镜检查眼底，但该诊断手法的准确性比较依赖于医生的专业水平以及经验。因此，RB的诊断和治疗需要新型的影像技术和合适的动物模型。

近年来，斑马鱼（Danio rerio）已然成为了一种研究人类疾病的优良模式动物，其与人类基因的同源性高达85%，且在组织器官发育起源及发育过程等方面都具有高度的同源性。同时，斑马鱼具有繁殖能力强、体外受精体外发育、胚胎透明易观察、生长发育快等生理优势［9］，被大量应用于癌症研究、药物研究、遗传研究及心理研究等［10］，其中就包括视网膜疾病的研究。与其他动物模型相比，斑马鱼的视网膜并不停止发育，成熟斑马鱼的视网膜仍然具有增殖的能力，所有类型的视网膜细胞都能不断从睫状缘的周围发生中心产生；斑马鱼视锥细胞也能不断地由视锥祖细胞生成，具有显著的再生能力［11］。当斑马鱼视网膜受到人为破坏时很少死亡，并能自身愈合伤口，其成活率较高［12-13］。因此，在斑马鱼玻璃体下植入RB细胞后，其良好的再生机制有利于我们观察RB细胞在斑马鱼玻璃体中的分布及存活的情况。

光学相干层析成像（optical coherence tomography，OCT）是一种可以实时成像、低损、高层析度、高分辨度、非侵入性的医学成像技术［14-16］。相较于体视显微镜成像的双通道光路成像原理，光学相干层析术基于弱相干光干涉仪的基本原理具有更强的层析能力，可检测生物组织不同深度层面对入射弱相干光的背向反射或散射信号的强度，通过扫描可以得到生物的二维或三维组织成像［17-19］。OCT能够利用眼中不同组织对光的不同反射，进而分析并显现出组织的断面结构。之前的研究表明，OCT十分适合成年斑马鱼的生命科学研究［20-22］。根据成像目的、病变位置等可以选择合适的OCT扫描方式如水平、垂直、环形、放射状等不同的角度进行线性扫描。目前，OCT已经被应用于探测人体软组织的早期癌变，相对于活组织检查更加快速清晰。另外，OCT不仅可用于监测眼部黄斑肿瘤和局灶复发的情况［23］，还可以用于检测糖尿病性视网膜病变、青光眼等疾病［24］。斑马鱼视网膜结构与哺乳动物结构相似，其结构由里到外包含内界膜、神经纤维层、神经节细胞层、内网织层、内颗粒层、外网织层、外颗粒层、色素细胞上层和感光层、脉络膜、毛细血管［25］。哺乳动物（以人为代表）的视网膜结构由里到外包含内界膜、神经纤维层、节细胞层、内网层、内核层、外网层、外核层、外界膜、视杆视锥层、色素上皮层。已有文献建立了RB斑马鱼的模型，但是尚未见到使用OCT监测方法对模型进行监测。基于以上，我们拟构建玻璃体RB斑马鱼模型，并利用OCT技术对该模型的RB细胞扩散过程进行活体、无损的动态成像，同时利用体视荧光成像（stereo fluorescence microscope，SFM）同步观察来进一步验证OCT成像结果的准确性。

1 材料与方法

1.1 试验动物

本研究随机选取了24条大小一致的正常斑马鱼作为研究对象，其中21条鱼用于构建RB斑马鱼模型，剩余3条鱼作为对照。正常情况下拍摄斑马鱼右眼的OCT图像和体视显微镜图像后，将这24条斑马鱼分别编号并置于不同容器中培养。斑马鱼的生活环境均相同，其饲养环境为（28±0.5）℃的水体，给予周期为14 h和10 h的明暗光照。

1.2 试验仪器

台式低速离心机（型号：L530）购自湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；医用净化工作台（型号：SW-CJ-2F）购自苏州市苏杭科技器材有限公司；可调移液器（1 000 μL、10 μL～100 μL）购自上海奥陆生物科技公司；二氧化碳培养箱（型号：3543）购自美国赛默飞公司；体视显微镜（型号：XTT-B3）购自上海谱骞光学仪器有限公司；SFM显微镜（型号：TL5000 Ergo）购自德国徕卡公司；OCT仪（规格：HSO-3000）购自深圳市生强科技有限公司。

本研究采用的是频域OCT系统，其结构如图1所示。本OCT系统的光源发射器件是波长为840 nm的超辐射发光二极管（superluminescent diode，SLD），扫描范围为2～15 mm，最大二维扫描速度为32 f/s，轴向扫描频率为18 kHz。经过测量，本系统轴向分辨率约为8 μm，横向分辨率约为12 μm，成像深度可达2 mm左右。它利用宽带光源的低相干性，通过反射镜位置与相应的后向散射光干涉信号强度获得样品不同深度的测量数据，对生物组织内部微观结构进行高分辨率层析成像。其核心部件是宽带光源照明的迈克尔逊干涉仪和光谱仪，相较于时域OCT系统，其记录的后向散射光的强度仅作为光谱频率而不是时间的函数，极大地提高了获取速度。同时谱域OCT信号在光谱密度中作为一个傅立叶重构的结果被采样，改善了信噪比。

图1 光学相干层析成像系统示意图Fig.1 Schematic diagram of optical coherence tomography system

1.3 绿色荧光蛋白标记的RB细胞

本研究所用的RB细胞购自美国模式培养物集存库（American Type Culture Collection，ATCC），采用慢病毒转染的方法让细胞可以表达绿色荧光蛋白，将稳定表达的细胞冻存在-80℃冰箱中。在斑马鱼建模前3 d复苏绿色荧光蛋白标记的RB细胞并传代，保证其生长状态良好。待绿色荧光蛋白标记的RB细胞生长至80%～90%时，离心后重悬细胞，将细胞悬液按照1∶2～1∶4传代，然后接种于2～4个培养瓶中，加入适当培养液，置于37℃、相对湿度95%、CO2含量为5%的培养箱中常规培养。每日观察细胞的生长状态，当培养液颜色发生变化或者培养基内杂质过多时更换培养液。收集对数生长期细胞进行试验、计数、离心，用不含血清的培养液重悬细胞，调整细胞密度分别为1.0×107、2.0×107、3.0×107个/mL备用。

1.4 试剂配制

配制质量分数为0.01%的Tricaine溶液（麻醉剂）：Tricaine（西格玛，A5040，美国）粉末溶于Holtbuffer缓冲液中，配置成质量分数为0.40%的储备液，试验前需将储备液加过滤水稀释到0.01%，即得到麻醉所用的工作液。

1.5 玻璃体肿瘤斑马鱼模型的构建

收集对数生长期细胞进行试验、计数、离心，用不含血清的培养液重悬细胞，调整细胞密度分别为1.0×107、2.0×107、3.0×107个/mL。经多次反复试验观察得出，当荧光细胞悬液密度约2.0×107个/mL时，其在荧光体视显微镜或OCT中的成像均清晰可见，呈现出颗粒状细胞团。因此，本研究最终选用密度为2.0×107个/mL绿色荧光蛋白标记的RB细胞悬液用于模型构建，注入20 μL该悬液至斑马鱼右眼的玻璃体内。

注射RB细胞前，首先用质量分数为0.01%的Tricaine溶液将斑马鱼麻醉，然后对其进行先右后左、由外向内的眼科外观检查，确保眼眶无外伤、红肿，玻璃体无增大、变小、凸出、内陷、偏斜、震颤等异常现象。随后将斑马鱼摆放在玻璃皿中，右眼朝上，左眼朝下，在OCT引导下将RB细胞悬液用微量注射器注射到其右眼玻璃体中。为了保证斑马鱼造模时处于一个相对湿润的环境，实施该过程时应在斑马鱼上下方都铺垫湿润的纸巾。

1.6 RB细胞植入后斑马鱼的饲养

成功植入绿色荧光蛋白标记的RB细胞后，将斑马鱼按原有的编号顺序放置回对应的容器里面，同时保证饲养水环境相对洁净，水更换周期为2 d/次，每次换水时应注意要保留1/3的原有水，再添加2/3的洁净饲养水。同时，试验期间给予斑马鱼适量的活虾卵，保证所有斑马鱼能成功进食，并且尽量保证每一条斑马鱼的进食量相同。

1.7 OCT成像斑马鱼眼睛

将已麻醉的斑马鱼摆放在玻璃皿中，右眼朝上，左眼朝下。玻璃皿放置于OCT系统下，对斑马鱼玻璃体植入细胞前后进行OCT活体成像。按试验设计方案对造模后的斑马鱼的玻璃体内RB细胞进行活体监测，从而获得扩散现象的实时数据。

1.8 SFM成像斑马鱼眼睛

将已麻醉的斑马鱼摆放在玻璃皿中，右眼朝上，左眼朝下。玻璃皿放置于SFM系统下，对斑马鱼玻璃体植入RB细胞前后进行SFM活体成像。按试验设计方案对造模后的斑马鱼的玻璃体内RB细胞进行活体监测，从而获得扩散现象的实时数据。

1.9 测量和统计方法

RB细胞在OCT图像和SFM图像中的强度和分布面积均是使用专业软件MATLAB在图像上测量获取的。收集的数据通过Origin处理分析，基于定量数据说明RB细胞在玻璃体中的存活状态。

2 结果与分析

2.1 建模过程中斑马鱼的行为学表现

RB细胞注射进入玻璃体后，立刻将斑马鱼转移到饲养水中，并放入增气泵。所有模型组斑马鱼都在建模后30 s内自行苏醒。与正常斑马鱼相比，模型组斑马鱼游动无异常，但由于视网膜有一定程度的受损，因此模型组斑马鱼视力有一定程度的下降，对悬浮在水面的鱼饲料无反应，但对在水中活动的活虾卵有进食反应。

2.2 造模前后斑马鱼眼睛的OCT和SFM成像结果

RB细胞注射前斑马鱼玻璃体的OCT图像如图2a所示，建模后斑马鱼玻璃体的OCT图像如图2b所示，两图均为玻璃体的横切面。对比这两幅图可以清晰地看到绿色圆圈中从建模前的全黑到建模成功后的暗黄色亮点，这是由于RB细胞团的高光散射特性导致的OCT信号强度增大。正常斑马鱼玻璃体的荧光体视显微镜图像如图2c所示，建模后斑马鱼玻璃体的荧光体视显微镜图像如图2d所示，两图均为玻璃体的面成像结果，成像深度为斑马鱼玻璃体内部一个薄的焦平面。对比两图，可清晰看到绿色圆圈内的细胞团样荧光颗粒，说明绿色荧光蛋白标记的RB细胞成功植入到斑马鱼玻璃体内。由于OCT图中斑马鱼骨骼的强度过高，导致细胞团的对比度较差，故接下来利用虚拟切片对OCT图像进行了分割重建。

图2 斑马鱼玻璃体注射前后的OCT图像与对应的SFM图像Fig.2 OCT images of zebrafish vitreous body before and after injection as well as SFM images

2.3 斑马鱼玻璃体内RB细胞生长过程的OCT与SFM长时间监测

斑马鱼的玻璃体内植入RB细胞后，我们利用OCT和SFM对如图3a所示的斑马鱼进行了长达72 h的监控，以确保覆盖一个细胞的繁殖周期。图3b是玻璃体内注射RB细胞后不同时间点的OCT图，图3c是玻璃体注射RB细胞后不同时间点的SFM图。为了更好地与SFM结果相匹配对应，OCT图像采用投影方法将眼球的三维数据压缩到一个二维图像上，这样做可以让分散在整个玻璃体内部的RB细胞分布情况都显示出来。对照观察OCT和SFM图像可以发现，在0 h时，绿色荧光蛋白标记的RB细胞在玻璃体内植入成功，通过OCT与SFM成像均可观察到肿瘤团样。在24 h的 OCT图和SFM图中可以明显地观察出RB细胞数量减少。相较于SFM图，OCT图能观察出绿色荧光蛋白标记的RB细胞在玻璃体内零落分布的情况。而SFM图并不能明显分辨出小颗粒的荧光细胞团，图中发光的边缘区域呈现的光亮由发亮的荧光绿演变为雾状感的绿色。在48 h的 OCT图和SFM图中依旧可以明显地观察出RB细胞数量减少。与24 h的图对比，OCT图能观测到绿色荧光蛋白标记的RB细胞分布的区域减少，但个别亮点的面积有增大的现象，SFM图的亮绿荧光区域减少较多，雾状感的绿色区域也大幅减少。72 h时，SFM图可以观察到RB细胞继续减少，荧光几乎无法看到，而OCT图能明显观察到中心橙黄色亮点的面积有增大的现象。综上所述，OCT图与SFM图表现出来的绿色荧光蛋白标记的RB细胞存活状态整体情况一致，但OCT能反映出一些体视显微镜观察不明显的细节，如中心绿色荧光蛋白标记的RB细胞团在72 h相较于48 h增大的现象。

图3 OCT与SFM活体监控斑马鱼玻璃体注射后荧光细胞的分布情况Fig.3 OCT and SFM in vivo monitoring the distribution of the living fluorescent cells in vitreous body

2.4 定量分析OCT图像评估RB细胞的存活情况

定量的数据可以更加客观地显现出视网膜母细胞瘤斑马鱼细胞的存活情况，因此，我们从成功建模的斑马鱼中选取每个时间点的OCT图像并进行数据处理分析，以评估玻璃体内细胞存活数量和癌干细胞的分布情况。图4a为斑马鱼玻璃体进行OCT的三维压缩二维图像。图4b是通过阈值法将噪声背景去掉后的结果。图4c为图4a灰度处理后进行二值化后的图像。通过该处理，我们可以直观地观察到斑马鱼玻璃体内的RB细胞分布。该过程呈现的趋势为斑马鱼玻璃体内RB细胞数量整体下降，但中心集聚的RB细胞团在24～72 h内可观察到一定程度的面积增大。图4d在图4a的基础上进行了RB细胞团凸显处理，将亮度低、活性不强的细胞筛选出去。通过该处理，我们能观察到0～24 h的RB细胞由于机体内免疫系统的作用及环境变换，短时间内大部分失活死亡。RB细胞团会在玻璃体内进行无规则运动，中心RB细胞团有移动、扩大的趋势。

图4 OCT图像处理后结果Fig.4 The result of OCT images processing

进一步分析不同时间点的OCT图像和SFM图像结果，对玻璃体内RB细胞分布面积作出点线图（图5）。对比发现，玻璃体内RB细胞的分布面积在0～24 h中呈现迅速下降的趋势，不同的是，OCT结果显示的下降速度要大于SFM结果。50 h后的OCT结果与SFM结果基本一致，均显示RB细胞面积不再缩小。在此基础上，我们对OCT图像和SFM图像中RB细胞的亮度情况进行了定量分析（图6）。SFM结果显示玻璃体内RB细胞的光强度在72 h内持续下降，OCT结果显示0～24 h RB细胞的光强度先上升，随后持续下降。

图5 定量分析玻璃体内RB细胞存活数量的变化过程Fig.5 Quantitative analysis of the changes in the number of RB cell in the vitreous body

图6 定量分析玻璃体内RB细胞光强度的变化情况Fig.6 Quantitative analysis of the optical intensity of RB cell in the vitreous body

3 讨论

斑马鱼眼睛的形态、解剖结构以及其控制眼睛发育的基因表达等方面与人类存在着极大的相似性，其现在已经广泛应用于眼部疾病的研究。眼部疾病是全球范围内备受关注的公共卫生问题之一，目前研究眼睛的手段有经典的眼底荧光素血管造影、钙化检测、病理检测等。但现存的方法都存在自身的局限性，组织病理学检查不仅步骤繁琐，而且可能还会发生RB细胞转移等，其他影像技术有些存在辐射损伤，可能会促使携带病变基因的患者诱发原发性癌症等。OCT技术已经成为一种眼部疾病的诊断的金标准应用在临床上，得益于高分辨率、成像速度快的优点，其在基础研究中的应用也在快速拓展［12,26］。SFM技术的对比度高，被广泛应用于RB细胞的增殖和迁移研究［27］。

本研究利用OCT和SFM成像技术对RB细胞植入斑马鱼玻璃体以及随后的扩散过程进行活体监测。根据数据可以推测出斑马鱼玻璃体绿色荧光蛋白标记的RB细胞总体数量呈线性下降。在0～24 h之间，RB细胞受免疫系统影响不大，由分散状态做一定运动聚集在一起，其数量和活性有一定的上升趋势；24～72 h时，玻璃体内整体的RB细胞对该环境不太适应，且有免疫系统的作用，其数量和活性都下降且呈线性关系。Chen等［28］的研究表明，SFM技术可以监控荧光标记的RB细胞在斑马鱼体内的转移，RB细胞注射进入斑马鱼眼睛后的面积会在10 d内逐渐减小，该结果与本研究一致。同时，我们发现，建模后斑马鱼玻璃体内细胞团的光亮强度表现得不一样，且光强较强的细胞存活时间也更久，因此我们推测这些细胞是RB细胞团里面的癌症干细胞。本研究目前存在一些问题。一个问题是RB细胞在斑马鱼玻璃体内的生长发育过程不统一。具体来讲，21条模型斑马鱼中的15条鱼玻璃体注射24 h后，OCT和SFM就不能检测到RB细胞团，又有4条鱼在注射48 h后，RB细胞团消失，最终仅剩2条鱼可以在72 h检测到RB细胞增多的现象。接下来，研究组将在如何提高RB细胞的成活率方面进一步开展工作。另一个问题是OCT和SFM定量结果在24 h的时候存在不一致的情况。我们认为有两方面原因：一是SFM成像的焦深不够，以至于不能显示玻璃体内全部RB细胞的荧光图像；二是OCT成像的分辨率还要进一步提高，以检测到分散的RB细胞。

综上所述，OCT技术能精准无损地活体评估斑马鱼视网膜母细胞瘤的存在状态和扩散过程，获得的OCT图像质量可以和SFM图像质量相媲美。由于OCT技术有较强的层析能力，对比SFM来说，甚至有更直观的观察优势。我们相信，OCT技术的实时性、安全性、无创性和可靠性在眼睛研究方面具有广阔的应用前景，特别是在眼内肿瘤疾病的演化过程研究方面具有明显的研究优势。