胡红蕾，于心田，孙冬冬，刁娟娟

（1.山东中医药大学，济南 250014；2.山东中医药大学第一附属医院，济南 250014）

小儿肾病综合征（nephrotic syndrome，NS）是一组因肾小球滤过功能失常而出现的以大量蛋白尿、低蛋白血症、高脂血症及水肿为主要特点的临床综合征［1］，以2～8岁的儿童常见，西方医学的发病机制尚不完全明确。大量研究发现其可能与免疫失调相关［2-6］。目前一线治疗药物为糖皮质激素，但是会出现生长抑制、代谢紊乱、感染加重等多种副作用，常见激素依赖和激素耐药的现象。尤其对于难治性肾病，往往需要二线免疫抑制剂治疗，但不同患儿治疗效果差异大，同时又伴有严重的副作用，给患儿及家长带来了极大的困扰。

防己黄芪汤出自《金匮要略·痉湿暍病脉证并治》。“风湿，脉浮身重，汗出恶风者，防己黄芪汤主之”为益气祛风利水的经典方剂。现代大量研究表明，此经方在调节免疫功能、减少尿蛋白和改善肾功能方面有不错的效果［7-10］，但其治疗小儿NS的作用机制缺乏具体研究。中医网络药理学方法利用新的“网络靶点多组分”模式，从系统的角度和分子水平诠释中医，并以高通量方式分析配方，同时解释了草药配方的组合规则和网络调节作用［11］。本文基于中医网络药理学对防己黄芪汤中的药物、疾病靶点、富集通路、生物过程进行系统和分子层面的研究，并通过分子对接对关键靶蛋白与药物小分子的结合效果进行验证，以期为进一步的机制研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 筛选药物有效成分及靶点

先在中药系统药理学数据库与分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）中依次输入 “防己”“黄芪”“甘草”“白术”等检索成分，同时挖掘现有文献补充未挖掘到的成分，后对所得成分去重整理，并在TCMSP平台上进行靶点预测，再通过Uniprot数据库（https://www.uniprot.org/）规范靶点。

1.2 预测疾病潜在靶点

分别在OMIM（https://omim.org）、DisGenet（https://www.disgenet.org）数据库中输入“Nephrotic syndrome in children”“Pediatric nephrotic syndrome”以获取小儿NS靶点，并查阅文献补充靶点，对靶点进行去重整理后，通过Uniprot数据库规范靶点。

1.3 绘制韦恩图获取交集靶点

把规范后的药物和疾病靶点导入韦恩在线平台（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）绘制韦恩图，其共有靶点即为防己黄芪汤治疗小儿NS的潜在靶点。

1.4 绘制交集靶点-成分-药物网络图

先构建共有靶点-防己黄芪汤成分-药物关系表，导入Cytoscape3.7.2软件绘制靶点-成分-药物网络图，再通过Network Analyzer工具进行自由度拓扑分析，最后依据自由度选取关键成分。

1.5 构建蛋白互相作用关系（PPI）网络图

先把共有靶点导入String11.0线上平台（https://www.string-db.org），“Organism”设置为“Homo sapiens”，置信度设置为 0.4，以获取蛋白互相作用关系（protein-protein interactions，PPI）网络图；再下载PPI tsv文件，并导入Cytoscape3.7.2软件进行拓扑分析以选取关键靶点，最后通过Mcode Cluster插件进行网络模块降维分解。

1.6 京都基因与基因组百科全书（KEGG）、基因本体论（GO）富集分析

Metascape是一个功能强大的基因功能注释分析工具，能帮助用户实现对基因或蛋白功能的认知［12］。先把共有靶点导入Metascape平台进行基因本体论（gene oncology，GO）的生物过程（biological processes）及京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集通路分析，再通过R语言实现结果可视化。

1.7 分子对接

对关键靶点和关键成分进行分子对接验证。先在Pemchem数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中下载蛋白配体，通过Chem3D、AUTODOCK转化为pdbqt形式；后在PDB平台（https://www1.rcsb.org/）上下载蛋白受体，通过pymol去除溶剂和有机物，去水、加氢、加电荷、计算电荷处理后保存为pdbqt形式；再结合文献确定活性口袋坐标，通过命令提示符输入对接命令对配体和受体蛋白进行对接验证；最后通过OpenBal、pymol处理对接后的蛋白结构以实现可视化。

2 结果与分析

2.1 防己黄芪汤成分的相关靶点

依据口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥ 30%、类药性（drug likeness，DL）≥ 0.18在TCMSP数据库检索到“防己”成分3个（靶点36个）、“黄芪”成分20个（靶点197个）、“白术”成分7个（靶点18个）。依据ADME 参数［脂水分配系数（AlogP）＜ 5、H 键供体数量（Hdon）＜ 5、H 键受体数量（Hacc）＜ 5、肠上皮通透性（Caco-2）≥ -0.40［13］］检索到“甘草”化学成分为62个（靶点109个）。对四味药物所对应的成分靶点进行整理去重后，共获得78个有效成分（206个靶点）。

2.2 小儿肾病综合征的相关靶点

通过OMIM、OMIM Gene Map、Disgenet数据平台检索到疾病靶点分别为89、859、1 538个，整理去除734个重复值，并补充文献挖掘所获取的2个靶点，最终共获得1 754个疾病靶点。

2.3 韦恩图和复方疾病的共有靶点

把206个药物靶点和1 754个疾病靶点导入韦恩在线平台，获得48个交集靶点，即为防己黄芪汤治疗小儿NS的潜在生物靶点（图1）。

图1 防己黄芪汤-疾病共有靶点韦恩图Fig.1 Vnne diagram of Fangji Huangqi Decoction disease common targets.

2.4 交集靶点-成分-药物网络图

把共有靶点、药物、作用于共有靶点的活性成分导入Cytoscape3.7.2软件绘成分-共有靶点-药物网络图，并通过Network Analyzer进行拓扑分析（图2）。图中包含48个共有靶点、68个药效成分（表1）、4味中药、 120个节点、491条边。选取图中自由度前五的活性成分为关键成分，其中活性成分中自由度最高的是槲皮素（quercetin），作用于34个疾病靶点，其次为7-O-甲基-异微凸剑叶莎醇（7-O-methylisomucronulatol）、4′，-甲氧基光甘草定（2-［(3R)-8，8-dimethyl-3，4-dihydro-2H-pyrano［6，5-f］chromen-3-yl］-5-methoxyphenol）、山奈酚（kaempferol）和美迪紫檀（medicarpin）。

表1 （续表）Tab.1 (continued)

表1 （续表）Tab.1 (continued)

表1 药物活性成分Tab.1 Pharmaceutical active ingredients

图2 防己黄芪汤活性成分-疾病药物共同靶点网络Fig.2 Network of target proteins of the active ingredient of Fangji Huangqi Decoction-drug disease

2.5 PPI网络图和子模块网络图

首先把共有靶点导入String平台，以获取PPI网络图（图3），图中有48个节点，261条边，平均节点度为10.9。然后以tsv格式下载并导入Sytoscape软件进行拓扑分析（图4a），舍弃3个游离靶点后，图中共45个节点，261条边。图4a中紫色图标为Degree值大于17的11个靶蛋白（表2），提示可能是防己黄芪汤治疗小儿NS的重要作用靶点。同时选取自由度前3的TP53、MYC、AKT1为关键靶蛋白。最后通过Cluster Maker插件的Mcode Cluster功能对其进行聚类分析，得到3个关系紧密的子功能模块（图4b）。Mcode 1（17节点模块）主要与癌症通路相关，Mcode 2（7节点模块）主要与PI3K-Akt信号通路相关，Mcode 3（3节点模块）主要与丙型肝炎相关。

图3 PPI网络图Fig.3 PPI network diagram

表2 蛋白互作网络重要靶点Tab.2 Important targets of protein interaction network

图4 PPI拓扑分析网络图及子模块网络图Fig.4 Protein interaction diagram and sub module

2.6 KEGG和GO富集通路

先把共有靶点导入Metascape平台进行KEGG通路富集分析，选取P值前20的通路，再通过R语言绘制气泡图（图5），图中气泡大小表示富集靶点数量，颜色表示P值大小，然后根据每条通路富集靶点数绘制条形图（图6）。结果表明，防己黄芪汤对小儿NS的治疗作用与癌症相关通路、MAPK信号通路、PI3K-Akt信号通路、丙型肝炎、乙型肝炎、卡波西氏肉瘤相关疱疹病毒感染、人巨细胞病毒感染等通路有关。通过Metascape平台对GO生物过程进行富集聚类分析（图7），图中节点表示通路，节点大小表示通路富集靶点的数量（靶点越多节点越大），边表示节点间的共同基因，边的宽度表示共同基因的数量（边越宽表示共同基因越多）。图7a中节点颜色依据P值大小变化而变化，图7b中节点的颜色依据不同的生物过程变化而变化。图8为绘制的聚类条形图，其分析结果主要涉及循环系统、细胞对氮化合物的反应、上皮细胞增殖、对机械刺激的反应、生长调节、蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶活性的调节、细胞分化、对无机物的反应、细胞对有机环状化合物的反应、肽基酪氨酸磷酸化体液水平的调节、腺体发育、心脏发育等多种复杂的生物过程。

图5 KEGG富集气泡图Fig.5 KEGG enrichment bubble diagram

图6 KEGG富集条形图Fig.6 KEGG enrichment bar chart

图7 GO富集聚类图Fig.7 GO enrichment cluster diagram

图8 GO聚类条形图Fig.8 Go clustering bar graph

2.7 分子对接

关键蛋白和关键成分的对接结果均小于-5.0 kcal/mol （图9），且AKT1与槲皮素、山奈酚、美迪紫檀素、4′，-甲氧基光甘草定的对接结果均小于-8.0 kcal/mol（图10、11）。结合能数值越小，表明对接效果越好，小分子化合物与大分子蛋白对接结构越稳定，越有可能发生相互作用。此结果验证了防己黄芪汤中槲皮素、7-O-甲基-异微凸剑叶莎醇、山奈酚、美迪紫檀素、4′，-甲氧基光甘草定有效作用于靶点AKT1、TP53、MYC的可能性。

图9 对接结构结合能热图Fig.9 Heat map of binding energy of docking structure

图10 分子对接结果模式图Fig.10 Molecular docking result pattern

3 讨论

肾病综合征在古籍中并没有完全对应的病名，但依据临床症状可归为“尿浊”“水肿”的范畴。《景岳全书·肿胀》中说：“凡水肿等症，乃肺脾肾三脏相干之病，盖水为至阴，故其本在肾；水化于气，故其标在肺；水唯畏土，故其制在脾。今肺虚则气不化精而化水，脾虚则土不制水而反克，肾虚则水无主而妄行”。 故本病病机主要与肺脾肾三脏失司相关，临床早期多以肺脾气虚，脾肾阳虚为主，迁延日久阳损及阴又可引起气阴两虚或肝肾阴虚。防己黄芪汤联合西医治疗不仅能有效改善肾病综合征患儿的免疫紊乱［14］，对患者 24 h 蛋白尿、肌酐、尿素氮和尿酸水平的调节具有显著优势，且不会增加不良反应［15］。

本研究共挖掘到防己黄芪汤相关靶点206个，疾病相关靶点1 754个，疾病复方共有靶点48个，防己黄芪汤中有68个活性成分作用于共同靶点。其中关键活性成分有槲皮素、7-O-甲基-异微凸剑叶莎醇、山奈酚、美迪紫檀素、4′，-甲氧基光甘草定，关键靶点为AKT1、MYC、TP53。结合目前研究发现，KEGG富集通路主要涉及MAPK信号通路、PI3K-Akt信号通路，GO富集分析结果主要涉及循环系统、细胞应激、蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶活性的调节及细胞分化等生物过程。

图11 蛋白结合位点结构图Fig.11 Protein binding site structure

关于活性成分，槲皮素是植物界分布广泛，具有多种生物活性的黄酮醇类化合物，可抑制肾间质中CD68+巨噬细胞的浸润，并下调 NF-κB p65和IRF5 的活性，使上游信号TLR4/Myd88失活，拮抗TGF-β1/Smad2/3信号的传导，从而抑制F4/80+/CD11b+/CD206+M2巨噬细胞的极化，以减少细胞外基质的过度积累和间质纤维化［16］。山奈酚具有抗癌、抗炎、抗病毒、防治糖尿病等多种生物活性，可显著抑制脂多糖诱导的急性肾损伤过程中炎症因子、炎症通路蛋白的升高，对急性肾功能损伤具有显著的保护作用［17］。美迪紫檀是二氢异黄酮的第二大类群，被认为是一类重要的植物抗毒素，具有抗菌、抗炎、抗氧化剂、免疫抑制活性抑制的作用［18-22］，而小儿NS与炎症反应、免疫紊乱密切相关，推测美迪紫檀素可通过调节炎症反应和免疫状况调控小儿NS。7-O-甲基-异微凸剑叶莎醇、4′，-甲氧基光甘草定虽作用于小儿NS的潜在靶点数量多，分子对接验证了其蛋白对接结构稳定，结合能力好，但目前仍缺乏相关研究，具体作用机制仍待挖掘。

关于关键靶点，AKT1 缺失会增加肾脏缺血再灌注期间的肾小管凋亡和炎症反应，从而加剧肾脏损伤［23］，而增强肾小管AKT1信号可减少再灌注后的肾损伤，提高存活率［24］。MYC为肾损伤过程中的关键靶蛋白，在肾脏特异性敲除小鼠中Cxcl12和MYC基因缺失会抑制线粒体代谢和糖酵解，并延迟缺血/再灌注损伤后的恢复［25］。AFB1 可通过PLK1、PLD1 和 MYC 上调 p21 的表达，诱导肾损伤［26］；TP53 是一种众所周知的肿瘤抑制因子，通过调节各种细胞生物学过程，包括细胞凋亡、细胞周期停滞和自噬，在急性肾损伤和随后的肾脏修复中发挥关键作用［27］。 慢性肾脏疾病与肾组织中的转化生长因子-β、p53、缺氧诱导因子的变化及主要发育途径的激活密切相关［28］。

关于富集通路， MAPK是一组能被不同的细胞外刺激（如细胞因子、神经递质、激素、细胞应激及细胞黏附等）激活的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶， 根据序列相似性、上游激活因子和次级特异性，可分ERKs、JNK、p38三大类。ERKs主要与生长因子相关信号相关，JNK和p38家族主要与细胞的应激和炎症反应相关。研究发现，p38、ERK1/2 和 JNK磷酸化后可有效减少急性肾损伤肾脏中凋亡细胞的数量［29］。激活p38 MAPK 信号通路能有效调控炎症反应，从而减轻肾切除大鼠的肾损伤［30］，同时MAPK的低表达可影响肾纤维化的进展［31］。PI3K蛋白家族参与细胞增殖、分化、凋亡和葡萄糖转运等多种细胞功能的调节。相关研究表明：激活PI3K/Akt 信号通路可减轻缺血再灌注肾损伤［32］；敲低PI3K的短发夹 RNAk可降低对纤维化的抑制［33］；减少PI3K信号传导可异位激活 β-连环蛋白途径，触发祖细胞的过早分化；PI3K信号通路联合其他通路可微调肾单位祖细胞自我更新和分化之间的平衡［34］。相关研究进一步证实了MAPK和PI3K-Akt信号通路在小儿防己黄芪汤通过复杂的生物过程多途径调控肾脏疾病中的重要作用。

综上，防己黄芪汤对于小儿NS的治疗主要依赖于MAPK和PI3K-Akt两条信号通路，并且通过槲皮素、7-O-甲基-异微凸剑叶莎醇、山奈酚、美迪紫檀素、4′，-甲氧基光甘草定等活性成分作用于MYC、AKT1靶蛋白，同时需要循环系统、细胞应激、生长调节、蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶活性的调节、白细胞分化等多种生物过程的参与来实现多成分、多靶点、多层次、多途径复杂的综合调控。本文揭示了防己黄芪汤治疗小儿NS的机制，并为临床进一步研究和应用提供了新的参考，但网络药理学方法仍有一定的局限性。首先，现有的数据库是不完整的，此研究数据中黄芪甘草的成分靶点信息量大，而防己、白术信息量少，可能会导致核心靶点关键成分筛选出现偏差；其次，网络药理学在中药方剂研究中的应用主要处于定性阶段，而无法涉及药物与疾病之间的量效关系，如在中医学中复方药物剂量的增减会改变药物的作用，那么药物剂量变化是否可影响关键成分和关键靶点的筛选，是否会导致生物过程的变化尚未可知。未来，随着网络药理学技术的普及和仪器分析、数据分析的发展，期待可以找到一种超高通量、快速、无损的方法来有效地解决上述局限性［35］。