李方一，李锦卫，黄 璜，官 梅，2，官春云，2*

（1.湖南农业大学 a.农学院；b.商学院，长沙 410128；2.国家油料作物改良中心湖南分中心，长沙 410128）

油菜叶面积作为衡量油菜光合作用大小的重要指标被广泛观测，其面积大往往被认为“源”充足，光合效率高，有利于油菜结实器官的形成与产量的增加［1］。油菜叶面积作为重要的株型指标和农艺性状，是油菜育种学家品种改良和评价的重要指标。因此对油菜叶面积的精准测量，特别在大田情况下实现多生育期的无损测量，对衡量油菜品种的光合效能、油菜表型组研究、油菜品种的改良等具有重要意义。

作物叶面积是指作物叶的功能器官被测量的单面叶片面积值。叶面积的测量根据测量标的的不同，主要分为单叶叶面积、单株叶面积、群体叶面积三个测量维度，其中单叶维度的测量是单株和群体维度测量的基础［2］。目前单叶维度的叶面积测量相对比较成熟，可按测量是否借助其他标的物面积的换算测量得到，分为直接测量法和间接测量法［3］，也可按测量过程是否对作物组织结构造成损害分为有损测量和无损测量。代表性的直接测量法有网格法、纸样称重法、叶面积仪法［4-5］、打孔称重法、鲜重法等，间接测量法有系数回归法（亦称“直尺法”，叶长宽积，以下缩写为L×W）、图像处理法、三维空间技术等。其中图像处理法随着数码相机、智能手机等的普及，因其成本低、精度较高、便携、可作无损测量等特点，近年来成为比较热门的研究。研究者们通过数码相机、扫描仪、手机等获取图像，选择不同算法对图像进行预处理、图像滤波去噪、图像分割、参照标的物的选择等，通过提取叶片图像像素值与参照物像素值进行比值换算测量面积值［6-11］。Dogan等［12］采用Photoshop CS6图像处理技术建立像素值、像素面积和叶面积的关系，测量了当地葡萄品种的真实叶面积，精度可达99.96%～100.00%。刘时城等［13］借鉴遥感影像的面向对象图像特征提取的思想，实现对叶面积图像特征值的提取和换算。另外，利用三维空间技术测量叶面积近年来取得了重要进展。研究者们构建植物三维模型［14］，或通过激光雷达［15］、手机［16］和Kinect传感器［17-18］等设备，采用不同算法重建植物的三维点云，通过计算网格面积计算出叶面积。这种三维空间技术能在一定程度上解决不在同一平面内的扭曲叶面的面积估测问题。以上方法大多采取有损方式进行，且处于实验室阶段，真正能在大田环境下开展无损测量的很少。

单株维度的作物叶面积的测量方法从大类划分主要有单叶累加法、抽样回归法、单株图像处理法等。单叶累加法是测量所有单叶叶面积后再进行累加得到其测量值。目前基于单叶累加法常用到的单叶测量方法主要有叶面积仪法、系数回归法、打孔称重法、鲜重法等。便携式叶面积仪可在田间作无损测量，操作简便，精度尚可，但造价较高，且不同设备对作物叶片测量时有规格限制，如LI-3000便携式叶面积仪只能测量叶片宽度小于12 cm（不含12 cm，以下同）的单叶。系数回归法亦可作无损测量，且操作简单，一般只需测量叶片长、宽即可，但通过建立回归模型进行预测的结果有一定的误差。Cristofori等［19］通过对叶面积与叶长和叶宽的乘积作回归分析，建立了几种用于估计柿树叶面积的模型，最准确的模型的决定系数R2=0.98。曹栎等［20］运用系数回归法分析发现，叶片的长宽积与实测叶面积的拟合度最高，最能反映实际叶面积的叶片参数。张新平等［21］所选的6种不同植物叶片面积与叶片长宽乘积的线性回归方程决定系数均较高，可以此法间接求算叶片面积。打孔称重法和鲜重法方法类似，只能作有损测量，通过打孔器或裁剪方式获得已知面积的叶片质量，通过采样叶片的质量与已知面积的叶片质量的比值换算即可得到采样大致面积。但这类方法一般仅适用于叶片质地比较均匀的作物品种，对于像油菜这种叶片不平整且存在褶皱的作物品种在测量时存在较大误差。以上单叶累加法因操作繁琐、工作量大难以完成，一般只在少量文献的试验方法部分作简单介绍，鲜有系统报道。

抽样回归法是不同生育期选择单株不同部位单叶或多叶测量其面积，与单株叶面积作相关性分析，通过建立与单株叶面积相关性好的单叶或多叶回归模型，预测单株叶面积。抽样回归法对于单叶或多叶的测量仍需采用以上单叶测量用到的方法，与单叶累加法不同的是，其不必对作物植株的每片叶进行测量。抽样回归法虽然更省工省时，但由于是间接测量，无法完全反映植株生长的真实情况，精确度相对较差。这种方法在测量样本较多或测量精度要求不高的情况较为常用。

单株图像处理法是通过对作物整株多角度拍摄获取图像，经图像处理与单株叶面积建立回归模型预测单株叶面积。其中用于建模和检验的单株真实叶面积的测量方法仍需采用以上单叶测量用到的方法。该方法作为间接测量的方法，既可做到无损，又能实现较高效率的测量。蒋霓［22］综合利用可见光成像、图像处理及统计分析等技术，结合自动化测量平台，构建了实验室环境下盆栽水稻单株绿叶面积的高通量无损测量，其建立的三个生育期水稻叶面积模型预测平均相对误差分别为9.02%、10.52%、9.84%。该方法能大大提高作物单株维度叶面积的测量效率，且测量精确度在合适的范围，笔者认为这也将是今后作物叶面积测量发展的趋势。但该技术目前仅限水稻，相关平台的筹建成本和对工作人员的要求都很高，对于油菜这种植株比较高大、枝叶比较复杂的作物，该类技术的应用还有一定的难度。

与其他作物相比，油菜叶面积的测量具有较大难度。如甘蓝型油菜一般具有长柄叶、短柄叶、无柄叶三种类型［23］，不同类型叶片面积差异较大，长柄叶面积可达600 cm2以上，短柄叶200～300 cm2左右，无柄叶大多不足100 cm2（图1）。油菜叶片不平整，叶面有褶皱，且存在叶羽之间相互遮挡的现象。另外，油菜植株比较高大，通过盆栽等方式实现实验室内大规模培养的成本较高，且无法反映大田的真实情况，故一般采取田间试验的方式培养，这给单株油菜叶面积的测量带来较大的难度。

图1 甘蓝型油菜长柄叶(左)、短柄叶(中)、无柄叶(右)Fig.1 Long stalk (left), short stalk (middle) and sessile (right) of Brassica napus L.

目前油菜叶面积的测量主要处于单叶维度的测量，具体方法与以上介绍的其他作物单叶面积测量类似。单株维度的测量主要是基于单叶累加法常用的打孔称重法、鲜重法、系数回归法等。打孔称重法、鲜重法采取有损方式进行，测量对采样植株的叶片造成破坏，且精确度较差。抽样回归法测量精确度较差，单株图像处理法测量条件和技术受限制，故均应用较少。

本研究是依托国家油料中心湖南分中心平台，作为理想株型育种研究的子项，目的是通过对油菜株型的考察，筛选有利于角果丰产的理想株型，其中单株维度的叶面积是重要指标之一。通过对以上各测量方法的不同特点进行分析和比较，结合本研究团队已取得的工作基础和条件，围绕“无损、高精确度和高效率”的测量目标，本文提出了一套根据油菜不同的生育期叶片的特点，有针对性地选择图像处理法、叶面积仪法、系数回归法（L×W）和纸样称重法四种方法综合运用的单叶累加测量策略，最终实现单株维度下田间多生育期油菜叶面积无损、高精确度和高效率的测量。

1 材料与方法

1.1 试验材料与设备

1.1.1 材料

本试验所选用的油菜单株样本来自于湖南农业大学油菜试验基地。试验时间为2017年10月至2018年5月，品种为早熟品种420（winterBrassica napusL.A1，株型紧凑）、中熟品种1035（winterBrassica napusL.A2，株型标准）、杂交品种991（winterBrassica napusL.A3，株型高大），进行了3个肥力处理（总养分≥45%的复合肥，N、P2O5、K2O各含15%），即0.053 kg/m2（B1）、0.068 kg/m2（B2）、0.083 kg/m2（B3），3个重复处理，每个小区的种植面积为10.8 m2，密度为15株/m2，于2017年10月初播种，苗期进行间苗、移栽。不同品种、不同施肥水平旨在创建大小、形状不同的单株样本。分别于2017年12月24日、2018年3月11日、2018年3月31日3个生育期（苗期、初花期、盛花期）对每个小区的3～4株同一代表样株持续进行单株维度的叶面积无损测量，共83株。本研究中油菜单株叶面积是指油菜植株所有叶片单面面积值，其中长柄叶、短柄叶面积含叶柄部分的面积。

1.1.2 主要设备和软件

主要设备有多媒体电脑、Li-3000C便携式叶面积仪、苹果iphone 6手机、直径为30 mm的黑色引磁片（工业级）、白色硬纸板、直尺等。

主要软件有采用本课题组自行开发的“农作物数字图像分析系统”［24］（CMS2.0，以下简称“图像系统”，计算机软件著作权号：2011SR065145）、DPSV7.05版数据统计分析软件、常用Adobe Photoshop、Office办公软件等。

1.2 测量方法和技术路线

由于需要考察同一株油菜多生育期叶面积的变化情况，故首先要做到无损测量，不对植株后期生长造成影响，在此前提下尽可能实现高精确度和高效率，最终确定了图像处理法、叶面积仪法、系数回归法（L×W）和纸样称重法四种方法的综合运用。首先，建立前三种无损测量方法与纸样称重法的校正模型，分析比较三种方法精确度和测量效率。通过选取不同样株、不同叶形的叶片若干片，其中一部分叶片分别用图像处理法、叶面积仪法和系数回归法（L×W）作无损测量，再用纸样称重法作有损测量，通过纸样称重法的测量结果与图像处理法、叶面积仪法和系数回归法（L×W）三种方法的测量结果进行相关性分析，建立三种方法的校正模型；再用另一部分叶片检验比较三种方法校正模型的精确度，同时比较三种方法的测量效率，以上过程简称为“校正试验”。分别统计苗期、初花期、盛花期样本叶片数量和分析叶形特点，根据“校正试验”的结论确定运用三种测量方法的方案。实施叶面积测量，分析测量结果的合理性。本研究技术路线如图2。

图2 研究技术路线Fig.2 Research technical route

1.3 测量原理和操作

1.3.1 图像处理法

图像处理法是一种图像处理技术与数据分析相结合的研究方法［25］。基本原理是通过专门设备按照相应标准获取含标准参照物的叶片图像，标准参照物的面积已知，通过专门软件提取叶片图像像素和标准参照物像素，通过计算叶片图像像素与已知面积标准参照物像素的比值，即可得到叶片面积值。本研究中获取图像的设备即笔者平时所用苹果iphone 6手机。根据龚爱平等［26］研究的结论，当手机和叶片的拍摄距离在300～600 mm之间时，测量结果与叶面积仪测得的结果偏差最小，因此本试验拍摄距离以此为标准。经反复比较，选用标准参照物为直径为30 mm的工业级黑色磨砂圆形引磁片，理由如下：一是引磁片主要用于固定、支撑手机，市面上容易获得且成本低；二是黑色磨砂型可避免拍摄时反光，减少误差；三是可通过背景硬纸板背面贴磁铁的方式调节引磁片位置，有利于与叶片形成最佳参照位置。作为参照物的引磁片一般使用2个，在背景硬纸板上呈对角线放置，可以减少可能因拍摄角度和距离的不同造成的误差。背景硬纸板选择白色有利于后期叶片、引磁片的图像分割。田间拍摄由两人配合，一人负责摆放叶片、标准参照物和背景纸板的位置，要求叶片尽量贴合背景纸板，与背景纸板保持同一平面；一人负责拍摄，手机尽量垂直硬纸板进行拍摄，要求画面清晰，避免反光、阴影和其他物遮挡，具体操作见图3。

图3 图像处理法田间拍摄Fig.3 Image processing method field shooting

提取像素和计算叶面积的专门软件是本课题组基于MatlabR2012a自行开发的“图像系统”。具体步骤如下：

1）参照物的选定。对参照物的选定是图像处理法精准测量的关键，通过图像系统的“自动处理”功能可自动分离出作为参照物的引磁片。通过人工选择的方式从2个引磁片中选定1个作为参照物并输入参照物的大小，原则上选择与叶片位置更靠近、角度更相近的作为最终确定的参照物。如果2个引磁片作为参照物可能都存在一定误差，可以分别选择不同的引磁片进行测量，取其平均值。

2）图像预处理算法的选择。图像的预处理包括图像的变换、去噪等，主要目的是便于后期图像的分割。通过对比，灰度变换和超绿变换可选作图像变换，中值滤波可选作去噪。

3）图像分割［27］。根据分割操作策略的不同可以分为基于阈值的分割、基于边缘检测的分割、基于区域的分割等。本次获得的图像是白色背景，叶片的绿色和白色在灰度上差异明显，故采用基于灰度的阈值法进行分割，通过反复对比发现，采用Otsu法阈值分割和最大类间类内距离比法的效果最好。如Nobuyuki Otsu给出的类间方差（intra-class variance，ICV）定义为：

图像灰度值的均值为M，任取一个灰度值t，则可将这个直方图分成前景色A和背景色B，这两部分各自的平均值为MA和MB，A、B部分的像素数占总像素数的比例分别记作PA和PB。这个最佳的阈值t就是使得ICV最大的那个值。

4）填充、去杂质等处理。由于叶片表面纹理、颜色深浅的差异且存在异物，以及背景可能存在的污垢、手指等，经过图像分割后的叶片图像会出现孔洞和杂质图像，会导致面积计算出现一定的误差。为减少以上误差，一般需经过“填充”“去杂质”“清除边界对象”“清除边界附近对象”“腐蚀”“膨胀”等操作去除干扰因素。图像处理过程如图4。

图4 图像处理过程Fig.4 Image processing process

5）叶面积计算。经过图像处理后，原来的叶片图像转换为一幅叶片为白色、背景为黑色的二值图像，利用Matlab中bwarea［28］函数统计像素值为1的所有像素的总数，即叶片部分的像素值，也称像素面积，然后通过与已知面积参照物像素值之间的比值关系即可得该叶片叶面积。

S表示面积，Pix表示感兴趣区域像素数。

6）叶面积校正。由于叶片测量时可能出现叶片卷曲难以完全铺平或叶羽之间相互遮挡等情况，通过图像处理法测量得到的叶面积值理论上要小于叶片的真实叶面积值。因此，对图像处理法测量得到的叶面积值进行校正是十分必要的。故每一个生育期测量时，需单独选取同一批次不同样本，不同大小、形状的叶片若干片，经图像采样后，采取纸样称重法测量真实叶面积，通过对图像处理法测量值与纸样称重法测量值作相关性分析和建立校正模型，对其他图像采样的叶片面积进行校正。

1.3.2 叶面积仪法

本试验采用LI-3000C便携式叶面积测量仪测量相关叶片。它使用了128个低频红光LED灯排成一排，每个LED灯位于每1 mm的正中央，共计128 mm，用来检测叶片宽度，因此该仪器仅限对叶宽在12 cm内的叶片测量。这些LED灯位于扫描头上半部分距边缘0.62 cm处，在测量过程中，将逐一点亮来计算这一排的方格数目。LI-3000C扫描头的下半部分有一个透镜式光敏二极管检测系统（图5），只对校准过的LED光脉冲有响应。在这一排的所有方格被扫描结束后，通过拉动编码轮拉绳（length encoding cord）继续进行下一排的扫描。拉绳每被拉动1 mm，便启动一次新的扫描来逐一点亮128个LED灯。由于拉绳每移动1 mm等于1 mm的长度，所以拉绳的运动方向必须垂直于128个LED灯构成的直线。在每次扫描中，每一个被样品遮挡50%以上的LED灯在总面积中累积1 mm2。例如，测量一个20 mm×100 mm的样品，共进行100次扫描，每一次扫描有20个LED灯被遮挡，那么得出总面积为20 cm2。

图5 LI-3000C扫描仪、扫描头结构和田间测量Fig.5 LI-3000C scanner, scanning head structure and field measurement

由于叶片测量时可能出现图像处理法测量时出现的情形，故亦需要对测量叶面值作校正，方法与以上图像处理法的叶面积校正方法相同。

1.3.3 系数回归法（L×W）

利用油菜叶片长度和宽度之积与叶面积值有很强相关性的特征，通过建立部分样本叶长宽积值与真实叶面积值的回归模型，对其他样本叶片面积进行估算。只需一人用直尺测量叶片最长、最宽的距离，获得相关数据后进行数据处理。

1.3.4 纸样称重法

纸样称重法是一种基于物理原理的测量方法，利用标准纸面积与质量成正比的特性进行换算得到叶面积值。首先，可通过高精度电子称称标准纸的质量，用直尺测量标准纸的面积，面积除以质量即可得单位质量纸的面积。然后，在标准纸张上完全临摹叶片形状，裁剪得到相应的标准纸，称得纸的质量再乘以单位质量纸的面积即可获得叶片的面积。对于大的叶片以及出现褶皱难以平摊的叶片可以剪成若干小块，避免叶羽遮挡造成误差。这种方法因完全临摹真叶大小，精确度很高，通常用于其他测量方法作校正用，其测量值作为真实叶面积值。

2 结果与分析

2.1 测量精确度的结果分析

考虑到不同生育期油菜叶片可能存在差异，为科学制订测量方案，在3个不同生育期进行叶面积测量前，均选取部分样本进行“校正试验”，并在不同生育期测量时采取相应生育期的校正模型进行测量结果的校正。每次“校正试验”均从3个品种和3个肥力处理的9个不同组合小区中随机选取3株油菜，对每株油菜上、中、下部3个不同部位的叶片（共计81片）分别采用以上4种测量方法进行测量，对其中每个小区随机选取的2株油菜3个部位的叶片（共54片）作相关性分析和建立校正模型；对每个小区的另一株油菜3个部位的叶片（共27片）进行精度检验。为了简化论证过程，以下分析具体结果采用3个不同生育期“校正试验”相应结果的平均值来表示。

2.1.1 图像处理法和纸样称重法的比较

对图像处理法和纸样称重法的测量结果作相关性分析，相关系数r为0.96**，达到极显著，校正前图像处理法测量叶面积平均值为纸样称重法叶面积平均值的0.79。建立的一元回归校正模型决定系数R2为0.91**，叶面积校正值相对纸样称重法测量值误差为2.94%。同时选取了部分样本进行了45°、60°、90°3个不同角度拍摄作图像处理法测量，不同角度拍摄测量结果作一个区组进行差异性分析，测量结果差异不显著，如表1所示。说明在大田情况下进行无损拍摄，对于因人拍摄角度差异造成的误差不明显，可以忽略，这与肖强等［29］、崔世钢等［30］的研究结果相似。

表1 不同角度拍摄的叶面积值的差异性分析Tab.1 Difference analysis of leaf area values photographed from different angles

2.1.2 叶面积仪法和纸样称重法的比较

对叶面积仪法和纸样称重法的测量结果作相关性分析，相关系数r为0.93**，达到极显著，校正前叶面积仪法测量叶面积平均值为纸样称重法叶面积平均值的0.71。建立的一元回归校正模型决定系数R2为0.86**，叶面积校正值相对纸样称重法测量值误差为4.47%。

2.1.3 系数回归法（L×W）和纸样称重法的比较

对叶长宽积值和纸样称重法测量结果作相关性分析，相关系数r为0.99**，达到极显著，校正前系数回归法（L×W）测量叶面积平均值为纸样称重法叶面积平均值的1.46。建立的一元回归校正模型决定系数R2为0.99**，叶面积校正值相对纸样称重法测量值误差为6.01%。

通过以上“校正试验”结果分析可知，以上三种无损测量的方法均可实现油菜叶面积的精确测量。相对而言，图像处理法精确度最高，叶面积仪法次之，系数回归法（L×W）最低。对于图像处理法和叶面积仪法校正前测量值偏小这一结果与之前的设想一致。不同生育期三种方法的“校正试验”结论基本一致，但测量结果的具体相关系数和校正模型的回归方程有所不同，以图像处理法为例，三个生育期建立的一元回归校正模型如图6所示。这说明不同生育期油菜叶片存在一定的差异，通过不同生育期建立相应校正模型有利于更精确的测量。

图6 不同生育期图像处理法与纸样称重法建立的校正模型Fig.6 Calibration model established by image processing method and paper weighing method at different growth stages

2.2 测量效率的结果分析

校正试验过程中随机选择5株样本进行测量效率测试，共计90片叶。分别用图像处理法、叶面积仪法和系数回归法（L×W）作无损测量，每种方法均由相同的两人进行操作，期间用秒表进行计时。其中图像处理法田间拍摄平均每株油菜的时间为198 s（不含前期编号等准备工作时间，以下方法相同），后期图像处理平均每株油菜所用的时间为1 180 s，平均每株油菜的测量时间共计为1 378 s（约23 min）。叶面积仪法田间测量平均每株油菜的时间为90 s，系数回归法（L×W）田间测量平均每株油菜的时间为126 s。考虑这两种方法后期数据处理均不需针对每片叶进行，可作批量处理，故不计后期数据处理时间，田间测量时间即测量总时间。通过以上“效率测试”结果分析可知，叶面积仪法测量效率最高，系数回归法（L×W）次之，图像处理法最低，但在人力可接受范畴内。

2.3 不同生育期测量方案的确定

根据以上精确度、测量效率分析的结论，结合苗期、初花期、盛花期样本叶片数量和叶形特点，本试验制定了不同生育期不同的测量方案。油菜苗期整体叶片数量不多，且以叶宽大于12 cm（含12 cm，以下同）的长柄叶为主，在人工强度能接受的前提下，主要通过图像处理法进行测量，系数回归法（L×W）对图像处理法测量结果进行对比分析，通过纸样称重法建立的校正模型进行校正。初花期、盛花期叶片数量陡增，如果再以图像处理法进行测量费工费时，难以完成。考虑这两个生育期内叶片主要是叶宽小于12 cm的短柄叶、无柄叶增加较多，且长柄叶逐渐脱落数量减少，故这两个生育期主要通过叶面积仪法测量叶宽小于12 cm的短柄叶、无柄叶，图像处理法测量叶宽大于12 cm的长柄叶，系数回归法（L×W）可用于少数残缺或漏测叶片的测量及对其他方法进行比对分析，通过纸样称重法校正模型进行校正。

2.4 不同生育期叶面积无损测量的结果分析

2.4.1 苗期叶面积

83株样本共计绿叶数769片，其中叶宽大于12 cm的长柄叶536片，占比70%。将其全部通过图像处理法进行测量，得到总叶面积为214 422 cm2，平均每株叶面积为2 583 cm2。其中A1、A2、A3平均每株叶面积分别为2 344、2 435、2 963 cm2，B1、B2、B3平均每株叶面积分别为2 183、2 624、3 003 cm2。另通过系数回归法（L×W）测量所有叶片，得到总叶面积为205 038 cm2，平均每株叶面积为2 470 cm2。其与图像处理法测量结果比较，总体相对误差为4.38%，不同品种、不同肥力处理样本测量相对误差在0.38%～9.54%之间，两种测量方法结果接近。对不同品种、不同肥力处理样本叶面积测量结果作差异性分析，测量结果在5%显著水平上差异比较显著，符合试验设计的预期。这也与马驿等［31］在油菜六叶期和蕾薹期不同氮肥水平下测量的叶面积差异水平结果相似。

2.4.2 初花期叶面积

83株样本共计绿叶数1 686片，相比苗期呈倍数增加。其中叶宽小于12 cm的短柄叶和无柄叶1 145片，占比68%，通过叶面积仪法测量，得到叶面积为104 609 cm2；叶宽大于12 cm的长柄叶541片，占比32%，通过取图像处理法测量，得到叶面积为206 889 cm2；总叶面积为311 498 cm2，平均每株叶面积为3 753 cm2。其中A1、A2、A3平均每株叶面积分别为2 592、3 880、4 745 cm2，B1、B2、B3平均每株叶面积分别为3 250、3 531、4 563 cm2。另通过系数回归法（L×W）测量所有叶片，得到总叶面积为288 623 cm2，平均每株叶面积为3 477 cm2。与以上两种方法测量结果进行比较，总体相对误差为7.34%，不同品种、不同肥力处理样本测量相对误差在4.94%～12.13%之间。对不同品种、不同肥力处理样本叶面积测量结果作差异性分析可知，测量结果在5%显著水平上差异比较显著，符合试验设计的预期。

表2 苗期油菜样本叶面积的测量结果Tab.2 Leaf area measurement results of rape samples at seedling stage

表3 初花期油菜样本叶面积的测量结果Tab.3 Leaf area measurement results of rape samples at initial flowering stage

2.4.3 盛花期叶面积

83株样本共计绿叶数2 055片，相比初花期又有大幅增加。其中叶宽小于12 cm的短柄叶、无柄叶1 685片，占比82%，通过叶面积仪法测量，得到叶面积为136 911 cm2；叶宽大于12 cm的长柄叶194片，占比9.4%，通过取图像处理法测量，得到叶面积为69 090 cm2；另因叶片数太多且作无损测量，小部分叶片出现漏测的情况，共176片，占比8.6%，用系数回归法（L×W）测量结果替代，叶面积为15 674 cm2；总叶面积为221 675 cm2，平均每株叶面积为2 671 cm2。其中A1、A2、A3平均每株叶面积分别为1 598、2 717、3 659 cm2，B1、B2、B3平均每株叶面积分别为1 979、2 677、3 463 cm2。另通过系数回归法（L×W）测量所有叶片，总叶面积204 354 cm2，平均每株叶面积2 462 cm2。与以上三种方法测量结果进行比较，总体相对误差为7.81%，不同品种、不同肥力处理样本测量相对误差在2.95%～10.91%之间。对不同品种、不同肥力处理样本图像处理法测量结果作差异性分析可知，测量结果均在1%显著水平上差异比较显著，符合试验设计的预期。

3 讨论

3.1 测量目标的定位

在大田情况下对单株维度的油菜叶面积进行多生育期无损测量是一项难度很大的工作。之所以难，其主要在于：一是要求进行无损测量，测量过程不得对样本造成破坏，测量过程只能在田间进行。这大大缩小了我们能用到的测量方法范围，测量操作难度加大，且难以实现“高通量”的目标。二是油菜叶片具有不规则性，无法用简单的计算公式和模型进行精确估算。如系数回归法（L×W）是一种相对比较简单、高效的方法，之所有没有优先选择，在于该方法的测量准确度相比其他方法要差些，对于精确度要求较高的试验而言，难以满足要求，但其仍具有辅助测量和对其他方法进行参考的价值。三是油菜叶片数量多，测量任务重，使我们在考虑测量精确度的同时，不得不考虑效率。因此，我们提出油菜单株叶面积的测量需要实现“无损、高精确度和高效率”三大目标。首先是实现无损测量，这是由本次研究的目标决定的，需要对同一株油菜多个生育期的叶面积进行测量，每次测量不对油菜后期的生长造成影响。高精确度测量是个相对的概念，当前对单株和群体的叶面积测量只能尽可能减少影响测量精确度的因素，而不能完全准确地进行测量［2］，是相对较高精确度的范畴。高效率是因为油菜单叶比较多，单株维度油菜叶面积测量任务比较重，故首先要确保能够在有限的人力、物力投入的前提下按时完成测量任务。

表4 盛花期油菜样本叶面积测量结果Tab.4 Leaf area measurement results of rape samples at full-blooming stage

3.2 高精确度和高效率之间的取舍

单株维度的作物叶面积的测量在大的方向上是选择单叶累加这种直接测量的方法，还是通过抽样回归或其他估算的间接测量的方法值得商榷。直接测量的方法是对单株所有叶进行测量累加得到的结果，相对最能反映真实情况。间接测量的方法是选取有代表性的或与单株叶面积相关性好的叶片面积作单株叶面积的估算。估算往往会忽略影响叶面积测量结果的诸多复杂因素，如叶片的形状、叶片质地、单株叶片数量、密度的不均匀、枝叶的相互遮挡等，其结果将叶面积测量的精确度稀释成无法评价其准确性的近似结果。如两株截然不同的单株样本可能因抽样的少量叶片面积大致相当导致估算的结果相似；或两株大体相近的单株样本可能因抽样的少量叶面积相差很大导致估算的结果大相径庭。基于群体维度叶面积的间接测量更是如此，如通过叶面积指数仪等测量的结果意义更多地体现在大致情况或变化特征，其准确性难以评价。刘镕源等［32］、Bréda等［33］均报道反映了通过间接方法测量的叶面积指数值不能区分叶片和枝干等其他器官遮挡的影响等，测量结果与其他直接测量法测量结果相差很大。本研究要求掌握油菜单株叶面积的真实情况，反映的是多叶的聚合效应，测量方法的不当容易造成测量结果出现较大的误差。单叶累加法具有抽样回归法等不可比拟的测量精度，符合本研究高精确度的测量要求，故作为本研究测量的基本方法。在大的方向上确定后，具体采用哪种方法实现单叶累加测量，则需重点考虑如何实现高效率的测量，这是我们完成测量任务的必要条件。

3.3 测量方法的选择

基于以上分析，单株维度的油菜叶面积的无损测量前提是做到无损，大方向上应以高精确度优先，大方向确定后具体测量方法选择上应以高效率为主，并兼顾高精确度。从无损测量角度考虑，图像处理法、叶面积仪法和系数回归法（L×W）均可作无损测量，对于大于12 cm的单叶叶面积测量可选择图像处理法和系数回归法（L×W）。从高精确度角度考虑，纸样称重法相对精确度高，但操作繁琐、效率低，且只能作有损测量，一般用于其他方法校正时运用。叶面积仪法虽可直接读取测量结果，但由于油菜叶片不平整且叶羽间存在遮挡，测量结果须作进一步校正。研究者通过对包括图像处理法、系数回归法（L×W）在内的多种叶面积测量方法进行比较，认为图像处理法精度较高［25，34-36］，本研究的结论也与之相一致。因此这两种方法从精度上考虑优先使用图像处理法。另外，基于单叶累加法测量单株维度油菜叶面积，因其叶片数多，特别在盛花期时单株油菜平均叶片数大于30片，且考虑是无损测量，在测量时可能出现叶片漏测的情况（采样过程中的确发生），因此对单株油菜每片叶测量叶长、叶宽，采取系数回归法（L×W）作漏测叶片的补充或其他方法的对比分析十分必要。从高效率的角度考虑，叶面积仪法操作最为方便，可直接读取叶面积值，效率最高，其他测量方法均须通过后期处理和计算才能得出结果，但该方法对被测叶片叶宽有限制，可优先作为叶片宽度小于12 cm的单叶叶面积测量的方法。以盛花期叶面积测量为例，如均用图像处理法测量，需增加耗时至少34 h。通过综合运用不同的测量方法，可克服单一方法的局限和不足，发挥其最大化优势，在当前测量技术水平和条件下不失为较佳选择。

3.4 同一种测量方法不同生育期校正模型的使用

根据以上“校正试验”分析，同一种测量方法在不同生育期建立的校正模型和相关系数有所不同。经对比，三种方法在三个生育期建立的一元线性回归校正模型的斜率均呈增大状态，如图像处理法三个生育期校正模型的斜率分别为1.06、1.27、1.36，系数回归法（L×W）三个生育期校正模型的斜率分别为0.55、0.57、0.59，说明三个生育期校正采样的叶片面积分化程度在扩大。导致分化扩大的原因主要有两个方面：一方面，三个生育期叶数呈较大幅度的增长，如苗期有769片，初花期有1 686片，盛花期有2 055片，而校正采样叶片的数量却没变，其校正采样占总体样本的比例变小，自然分化的可能性变大；另一方面，三个生育期不同类型叶片的比例发生较大变化，如苗期叶宽大于12 cm的长柄叶有536片，占比70%，初花期叶宽大于12 cm的长柄叶有541片，占比32%，盛花期叶宽大于12 cm的长柄叶只有194片，仅占比9.4%，这也意味着在形态和面积上存在更大差异的短柄叶和无柄叶的比例在不断增加，从而导致校正采样叶面积分化加大。由此可知，不同品种和不同生育期的油菜叶片无论是数量还是形态均存在较大差异，为提高测量精确度，即使是同一测量方法，在测量前也应针对不同品种和不同生育期建立相应的校正模型，正所谓“一测量一系数”。

3.5 单株维度无损测量具体方法的改进

尽管本研究取得了阶段性的进展，但仍存在诸多问题需作进一步改善。一是图像处理法测量应建立更可控的田间拍摄标准。尽管田间叶片拍摄前制订了相应的拍摄标准，开展了相应的培训，但在多达近2 000多张叶片图像处理过程中，图像中不乏出现手指、田间杂物等干扰因素，有的叶片不能完全贴合纸面，有的标物摆放的位置不佳，有的白色硬纸板在拍摄特大叶片时不能完全衬托，有的因光线原因导致形成了一定的阴影等，这些因素都对测量的精度造成了一定的影响。下一步需建立更具可操作性的相关标准，加强测量人员的培训和规范，及时排查不符合要求的图像，提高拍摄图像的质量。二是“农作物数字图像分析系统”（CMS2.0）需进一步升级，朝“高通量”的目标努力。相对来说，图像处理法误差较小，但后期的图像处理工作量较大，耗时较长。如本次试验处理了近2 000张叶片图像，按效率测试的结果处理1张图像平均需66 s，大约需要36 h左右。下一步将在实现田间拍摄标准化的前提下，开发出具有批量处理的功能，提高图像处理效率。三是为了进一步提高油菜叶面积无损测量的精度和效率，可根据不同的叶型（如短柄叶、无柄叶）进行分类处理和校正等。

本研究对单株维度油菜叶面积田间无损测量方法和策略进行了理论探析，并开展了相应的实证研究。确立了“无损、高精确度和高效率”三大测量目标，确定了综合运用图像处理法、叶面积仪法、系数回归法（L×W）和纸样称重法四种方法的单叶累加测量策略。通过测量精确度分析，图像处理法、叶面积仪法、系数回归法（L×W）均可实现油菜叶面积的精确测量，其中图像处理法的测量精确度最高，叶面积仪法次之，系数回归法（L×W）最低，测量误差分别为2.94%、4.47%、6.01%。图像处理法测量叶面积，对于因拍摄角度差异造成的测量误差不明显。同一方法通过不同生育期建立相应校正模型有利于更精确的测量。从测量效率来看，叶面积仪法的测量效率最高，系数回归法（L×W）次之，图像处理法最低，但在人力可接受范畴内。结合不同生育期叶数和叶形特点，并科学处理“高精确度”和“高效率”之间的关系，本试验制订了不同生育期叶宽大于12 cm的长柄叶主要通过图像处理法进行测量, 叶片叶宽小于12 cm的短柄叶、无柄叶主要以叶面积仪法测量，所有叶通过系数回归法（L×W）测量，用于少数残缺或漏测叶片的补充，以及对其他方法测量结果作对比分析，通过纸样称重法校正模型进行校正的测量方案。测量结果符合试验预期，基本实现“三大目标”。