杨 一，郝翊帆，李艾凝，王 佳，刘馨忆，王仁俊

(吉林师范大学 生命科学学院，吉林 四平 136000)

作为糖尿病并发症之一的糖尿病心肌病(Diabetic cardiomyopathy，DCM)，处于持续高糖状态时可使心脏功能代谢出现异常[1-2].众所周知，全球糖尿病发病率逐年增加，伴随的心血管疾病患者占糖尿病中死亡率和发病率的2/3以上[3].在DCM发展过程中，高糖和血脂异常可以通过直接调节心肌细胞内信号通路诱导细胞中粘附分子，细胞因子及趋化因子分泌增加引起心肌产生低度慢性炎症[4].炎症反应在DCM起着很大的作用，控制炎症以及调控相关的炎症通路或许能改善或者预防DCM发生.

表没食子儿茶素没食子酸酯(Epigallocatechin gallate，EGCG)作为茶多酚主要物质，占其总量70%以上，具备多种生理活性[5].研究发现EGCG对高糖诱导的心肌细胞损伤的抗炎效果显著[6].EGCG可以改善心肌细胞的氧化应激、降低心肌细胞凋亡率、并调控凋亡相关蛋白表达水平发挥抗炎作用[7].本文通过研究大鼠心肌细胞(H9C2)，进行高糖诱导以及建立细胞损伤模型，研究EGCG预处理后改善心肌细胞损伤及其相关分子机制，以期为DCM预防提供新思路.

1 材料与方法

1.1 材料

H9C2(中国科学院上海细胞库)，EGCG(上海生工)，SOD(WST-1法)和GSH-Px(比色法)试剂盒(南京建成公司)，TNF-α、IL-6 ELISA试剂盒(上海生工司).

1.2 方法

1.2.1 心肌细胞培养

将H9C2细胞于高糖(DMEM)培养基(添加10% FBS和1%双抗)中培养，CO2培养箱设置条件为37 ℃，5% CO2.

1.2.2 实验分组

分为3组：对照组、模型组(50 mmol/mL葡萄糖的高糖培养液处理)、药物组(100 μg/mL剂量预处理1 h后用50 mmol/mL葡萄糖的高糖培养液处理).

1.2.3 细胞存活率检测

将各处理组1×104cells/well细胞接种于96孔板中，培养48 h，然后采用MTT(四甲基偶氮唑盐)方法检测其存活率.

1.2.4 细胞SOD和GSH-Px测定

检测方法遵从试剂盒操作步骤.

1.2.5 细胞炎性因子TNF-α和IL-6检测

根据Mouse TNF-α和IL-6检测试剂盒操作步骤进行，酶标仪在450 nm波长处检测样本吸光度计算细胞因子表达量.

1.2.6 细胞中mRNA转录水平检测

提取RNA步骤遵从试剂盒说明书.样品cDNA反转录操作步骤遵从cDNA试剂盒.目的基因引物序列见表1.采用qPCR检测细胞中NF-κB、IκBα以及IL-1β mRNA转录水平.

表1 目的基因的引物序列Tab.1 Primer sequences of target genes

1.3 统计与分析

采用SPSS 20.0进行单因素方差分析.*表示P<0.05差异显著，**表示P<0.01差异极显著.

2 结果与分析

2.1 EGCG对H9C2心肌细胞活力的影响

如图1表示各组H9C2心肌细胞活力.与正常组(99.85±2.60)相比，模型组(74.48±4.24)心肌细胞活力明显下降(P<0.01)；与模型组相比，EGCG药物组(84.83±2.90)H9C2细胞活力显著增强(P<0.01).表明高糖诱导后的H9C2心肌细胞活力受EGCG保护.

图1 心肌细胞活力水平Fig.1 Myocardial cell viability level

2.2 EGCG对H9C2心肌细胞SOD及GSH-Px活性的影响

进一步检测了各处理组H9C2心肌细胞中抗氧化酶活性水平(SOD和GSH-Px)，结果如图2所示.模型组H9C2细胞中SOD(165.84±7.42)和GSH-Px(440.03±14.54)活性与正常组(SOD：270.57±13.73；GSH-Px：555.33±17.54)相较明显下降(P<0.01)；与模型组相比，EGCG药物组H9C2细胞中SOD(214.05±13.06)和GSH-Px(494.50±12.72)活性升高显著(P<0.01).表明高糖诱导后的H9C2心肌细胞中抗氧化水平可被EGCG增强.

图2 细胞中SOD(A)和GSH-Px(B)酶活性水平Fig.2 SOD (A) and GSH PX (B) enzyme activity levels in cells

2.3 EGCG对H9C2心肌细胞中促炎因子(TNF-α和IL-6)水平的影响

通过ELISA检测各组H9C2心肌细胞中TNF-α及IL-6抗体水平，结果如图3所示.模型组H9C2细胞上清液中TNF-α(179.84±16.02)和IL-6(232.72±16.78)抗体表达水平与正常组(TNF-α：47.96±9.22；IL-6：85.75±11.69)相较增多明显(P<0.01)；与模型组相比，EGCG药物组H9C2细胞中TNF-α(126.66±8.90)和IL-6(166.09±16.73)抗体表达水平明显下降(P<0.01).以上证明高糖诱导后的H9C2心肌细胞中促炎因子的表达量受EGCG抑制.

图3 心肌细胞中促炎因子TNF-α(A)和IL-6(B)水平Fig.3 Proinflammatory factor TNF-α (A) And IL-6 (B) levels in cardiomyocytes

2.4 EGCG对H9C2心肌细胞内相关基因表达水平的作用

RT-PCR检测各处理组H9C2心肌细胞中NF-κB、IκBα和IL-1β的mRNA转录水平，结果如图4所示.模型组H9C2细胞中NF-κB(4.64±0.22)、IκBα(3.29±0.34)和IL-1β(2.60±0.17)的mRNA转录水平同正常组相较上调明显(P<0.01)；与模型组相比，EGCG药物组心肌细胞中3个基因(NF-κB：3.10±0.27；IκBα：2.28±0.16；IL-1β：2.01±0.14)的mRNA转录水平显著下降(P<0.01).表明H9C2心肌细胞被高糖诱导后胞内NF-κB炎症信号通路相关基因转录水平可能被EGCG抑制.

图4 心肌细胞中NF-κB、IκBα和IL-1β的mRNA转录水平Fig.4 NF-κB、IκBα and IL-1β mRNA transcription level in cardiomyocytes

3 结果与讨论

DCM发病机制为高血糖诱导氧化自由基的生成，促进细胞的凋亡，进而导致细胞死亡[8].所以治疗糖尿病心肌病的重中之重是改善患者心肌状况.在机体损伤过程中，NF-κB是一种多效的调节因子并广泛存在真核生物细胞中，NF-κB信号通路对多种炎症反应中炎性介质基因进行转录和调控，在多种急性损伤的病理机制中地位举足轻重[9].NF-κB通路激活后可调控下游含有NF-κB结合序列的靶基因(如TNF-α、IL-1β、IκBα、IL-6等基因)的转录表达[10].EGCG作为茶多酚的主要成分之一，抗氧化和抗炎作用较好.EGCG抗炎机制可能是介导了抗氧化活性、抑制相关炎症信号通路相关因子表达等方面[11].作为强效的抗氧化剂，大量文献研究已证实，EGCG对细胞损伤亦具有较强的抗炎作用，尤其是心肌细胞[6-7].A.M.EL-Mowafy等报道，EGCG还可借由减少白细胞数量、抑制氧化指标活性、减轻全身炎症，以减轻CP引起的心脏等脏器损伤[12].

本文采用EGCG对高糖诱导受损的大鼠心肌细胞损伤的改善作用及相关分子机制进行了研究，检测发现给予EGCG后导致细胞抗氧化酶活性增强，并能够在一定程度上能够抑制TNF-α、IL-6、NF-κB、IκBα和IL-1β的表达量，高糖诱导的心肌细胞损伤减轻，细胞损伤过程中的炎症反应降低，其机制可能与激活NF-κB炎症通路有关，EGCG通过抑制NF-κB易位入核，进一步抑制TNF-α、IL-6等因子分泌，但具体分子机制还有待研究.

本研究表明EGCG可能通过NF-κB炎症通路减轻高糖诱导后的H9C2心肌细胞损伤，抑制细胞炎症反应.