李文仿 龙彬彬 姚方辉 赵宗彬 张华

近年来，乳腺癌的发病率呈上升趋势，已位居女性恶性肿瘤的首位［1］。阐明乳腺癌发生发展的分子生物学机制对提高其诊治水平具有一定意义［2］。N6—甲基腺苷（N6-methyladenosine，m6A）修饰RNA是近期肿瘤进展研究的热点。m6A修饰是真核生物mRNA常见的甲基化修饰，参与真核生物mRNA的运输、剪切、翻译等过程［3-4］。m6A修饰通过甲基化酶、去甲基化酶及甲基化识别酶等调控mRNA甲基化，参与膀胱癌、胃癌等恶性肿瘤进展［5-6］。去甲基化酶AlkB同源蛋白5（AlkB homologue 5，ALKBH5）与甲基化转移酶14（METTL14）、Wilms瘤相关蛋白（Wilms tumor 1 associated protein，WTAP）形成mRNA甲基化修饰复合体，是mRNA的m6A甲基化修饰主要调控单位，通过调控肿瘤基因表达，在恶性肿瘤进展中发挥作用［7］。本研究主要探讨乳腺癌组织中ALKBH5的表达及临床意义。

1 材料与方法

1.1 临床资料 收集2017年5月至2018年9月在本院进行乳腺癌手术切除石蜡标本90例，乳腺增生组织石蜡标本20例，以及相应乳腺癌患者的临床资料、免疫组化指标、病理检查结果等。

1.2 siRNA转染 转染试剂Lipofection2000，购自Invitrogen。ALKBH5 siRNA序列由上海生工合成，序列为siRNA1：5′-GCAGC AAGGCAGTCT TTA AGT-3′，无 效 干扰RNA没有相应的mRNA作用靶点（siRNA NC），序列为5′-UUCUCCGAACGUG UCACGU-3′。ALKBH5的siRNA按照转染Lipofection2000说明，转染乳腺癌细胞MDA-MB231。

1.3 RNA提取 收集细胞并裂解，每6 cm培养板的细胞中加入1 mL Trizol溶液，将细胞转移到无RNA酶离心管中。抽提：加入1/5体积的三氯甲烷，剧烈震荡1 min，充分混合后，室温静置 3 min；37 ℃，12 000 r/min离心10 min；将上层RNA层转移至新的无RNA 酶离心管。沉淀：加入等体积异丙醇，混匀，室温静置10 min；4 ℃，12 000 r/min离心10 min，可在底部观察到沉淀的RNA，弃上清保留沉淀。洗涤：轻轻加入1 mL现用现配的75%乙醇，上下颠倒洗涤沉淀及管壁；……