崔栋， 肖娜， 钟冠南， 杨晓华， 顾嘉颖， 洪文腾

深圳市盐田区疾病预防控制中心，广东 深圳 518000

肠道病毒和感染性腹泻病毒由于传播途径复杂，传染性强，控制难度大，易引起学校和托幼机构聚集性疫情，造成严重的公共卫生危害。肠道病毒主要包括脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、埃可病毒、新肠道病毒等在内的多个血清型，可致肠道与呼吸道感染、脊髓灰质炎、心肌炎、无菌性脑膜炎和手足口病等多种感染。2010年以来手足口病发病率一直处于我国法定传染病首位[1]。我国感染性腹泻的疾病负担主要集中在5岁以下儿童，其中轮状病毒性肠炎是我国5岁以下儿童感染性腹泻的主要疾病负担[2]。伤残调整寿命年(disability adjusted life years，DALYs)是反映疾病对人群寿命损失影响的综合指标，在 22 种食源性病原体中，诺如病毒DALYs 排名首位[3]。本研究对深圳市盐田区人群肠道病毒及常见感染性腹泻病毒感染情况进行分析，了解和评估其肠道病毒及常见感染性腹泻病毒隐性感染状况，为制定防控措施、评估疫情趋势及疫苗接种等提供科学依据。

1 对象与方法

1.1调查对象 2020年6月选取盐田区海山、沙头角、盐田、梅沙四个街道，采整群抽样方法在每个街道随机抽取1个社区，每个社区抽取居民200人，覆盖儿童、青年、中年、老年各年龄组人群，收集粪便样品。

1.2检测方法 取1～2 g粪便加入1 mL 生理盐水，震荡混匀，8 000×g离心5 min，取上清提取总核酸。采用实时荧光定量PCR方法检测粪便中诺如病毒、札如病毒、轮状病毒、星状病毒、肠道腺病毒、肠道病毒通用型、肠道病毒71型(enterovirus 71,EV 71)、柯萨奇病毒A16型(Coxsackie virus 16,CV-A16)。核酸提取使用西安天隆核酸自动提取仪，核酸提取试剂使用重庆中元汇吉生物有限公司核酸提取试剂盒(磁珠法)，具体操作方法参考试剂盒说明书。检测试剂购自深圳市奥东生物科技有限公司。

1.3基因组测序 选取RT-PCR阳性样本，提取病毒核酸后送上海伯杰生物科技有限公司进行病毒基因组全长测序。

1.4序列分析 通过Nucleotide Blast 功能对比 NCBI 数据库中与其最接近的已知基因序列进行检索，并获得相应型别的代表毒株序列。利用DNAstar中Seqman软件对测序结果进行拼接整理，整理好的序列由诺如病毒基因分型网站(http://www.rivm.nl/mpf/norovirus/typingtool/)进行基因分型、病毒序列比对和构建进化树。采用MEGA软件对病毒核苷酸进行序列比对和系统发育树构建。使用邻近(Neighbor-Joining)绘制进化树，Bootstrap Replications数值设置为1 000。

2 结 果

2.1基本情况 调查实际收集并检测粪便样品共813份，札如病毒、轮状病毒、星状病毒、肠道腺病毒、EV 71和CV-A16未检出；肠道病毒通用型检出2例，阳性率为0.25%；诺如病毒检出4例，均为诺如GⅡ型，阳性率为0.49%。诺如阳性样本编号分别为20SZYT0162、20SZYT0165、20SZYT0166、20SZYT1046。

2.2基因分型结果 选取核酸阳性标本进行序列测定，肠道病毒通用型均为幼童口服脊髓灰质炎疫苗所致；4份诺如病毒阳性样本成功测序2份，上传在线基因分型网站比对后显示20SZYT0166为GⅡ.2-GⅡ.P16型，20SZYT1046样本为GⅡ.17-GII.P17型。

2.3诺如病毒系统进化分析 20SZYT0166聚合酶区基因序列与2020年广州1174株(MT856644)处于同一分支且序列亲缘性关系最近，核苷酸同源性为 99.47%(图 1)。20SZYT0166衣壳区基因序列与2016 年北京BISCY株(KY421123)，2016年广东16SF2026 株(KY485116)、016T03株/T01株(KY457586/KY457584)，2017年浙江DingHai05株(MH057762)，2018年深圳2018046株(MK614132)以及2020年日本1047F株(LC646333)序列核苷酸同源性为100%(图 2)。

图1 诺如病毒GⅡ.2-GⅡ.P16型(20SZYT0166)聚合酶区系统进化分析

图2 诺如病毒GⅡ.2-GⅡ.P16型(20SZYT0166)衣壳区系统进化分析

20SZYT1046聚合酶区与2014 年上海1427004株(KT380915)以及2016年广东本土16F0784GDMM株(MH569708)、16F0791GDMM株(MH569706)、16F0791GDSZ株(MH569705)、16F0792GDSZ株(MH569704)、17F3414GDDG株(MH569702)的序列亲缘性关系最近，核苷酸同源性为100%(图3)。20SZYT1046衣壳区基因序列进化树分析表明，20SZYT1046毒株序列与2015 年浙江湖州N15002株(KY344348)、2015 年北京1514株(KT633395)以及2016年日本AichiF4株(LC349993)序列有较近的亲缘性关系，核苷酸同源性为 97.0%～97.3%(图4)。

图3 诺如病毒GⅡ.17-GⅡ.P17型(20SZYT1046)聚合酶区系统进化分析

图4 诺如病毒GⅡ.17-GⅡ.P17型(20SZYT1046)衣壳区系统进化分析

3 讨 论

肠道病毒隐性感染在人群中普遍存在，难以鉴别和发现，为疾病预防和控制带来困难[4]。采用Meta方法分析我国健康人群人类肠道病毒隐性感染情况，发现我国健康人群肠道病隐性感染率为18.8%，其中EV71隐性感染率为3.7%，CV-A16隐性感染率为1.9%，其他肠道病毒隐性感染率为15.1%[5]。采用酶联免疫分析方法检测西安市某医院221名健康体检人群外周血 EV 71-IgM，隐性感染率为8.14%[6]。研究发现儿童专科医院医务人员手足口病EV71和CV-A16隐性感染比例高，存在着一定程度EV71和CV-A16隐性感染情况[7]。本研究在健康人群中未能检测出肠道病毒，可能是由于采样时间为肠道病毒非流行期，且检测方法为单一核酸检测。

对北京市餐饮服务单位人员诺如病毒隐性感染情况调查发现，餐饮服务单位工作人员诺如病毒隐性感染率为0.29%[8]。浦东新区重点机构从业人员诺如病毒感染调查显示，共调查从事保育员、保洁员、营养员等工种的无症状从业人员589名，经核酸检测确认诺如病毒隐性感染8名，隐性感染率为1.36%[9]。本研究中盐田区健康人群诺如病毒隐性感染率为0.49%，与北京市餐饮单位人员结果接近，低于上海浦东新区。广东省诺如病毒感染暴发疫情基因型结果分析显示，GⅡ.2型主要涉及小学、幼托机构和中学，以接触传播为主；GⅡ.17型主要涉及中学和其他社会单位，以食源性传播为主，GⅡ.2和GⅡ.17型主要感染未成年人群，其中GⅡ.2型感染的人群年龄较GⅡ.17型更低[10]。2014年冬季，出现了一种新型的诺如病毒变异株GⅡ.17_Kawasaki_2014，在日本和中国等亚洲国家引起了一系列急性胃肠炎暴发[11]，随后我国多个城市相继暴发[12]。研究发现GⅡ.17-GⅡ.P17能和多种类型的人组织血型结合抗原(HGBAs)结合使得其侵袭力增强[13]。2016年底发现了一种以前较少出现的重组诺如病毒 GⅡ.2-GⅡ.P16，并成为我国诺如病毒暴发疫情的主要病原体[14]。我国2016年10月至2018年9月全国556起诺如暴发疫情调查发现，81.2%的诺如病毒暴发类型为GⅡ.2-GⅡ.P16[15]。研究发现GⅡ.2-GⅡ.P16株具有更强的复制能力，更有可能发生大流行[16]。 GⅡ.17-GⅡ.P17型和GⅡ.2-GⅡ.P16型诺如病毒在全球范围内具有持续和广泛的流行能力，且本次监测到的毒株与省内诺如疫情毒株序列高度同源，应进一步加强辖区诺如病毒的监测。

针对肠道病毒和感染性腹泻病毒的流行特点，相关部门应该采取措施加快相关疫苗接种工作，尤其是学校和托幼结构接种工作；制定严格的传染病管控措施，加强对重点人群、重点场所监测；此外应重视食品卫生和饮食习惯，开展健康教育，改善环境卫生，提升居民健康素养，倡导健康生活方式，有效降低肠道病毒和感染性腹泻病毒感染风险。