王宁宁，李晓月，刘泽文，刘 威，高 婷，周丹娜，杨克礼，郭 锐，梁 婉，陈文杰，贝为成，田永祥，袁芳艳

（1.湖北省农业科学院畜牧兽医研究所/农业农村部畜禽细菌病防治制剂创制重点实验室/畜禽病原微生物学湖北省重点实验室，武汉 430064；2.华中农业大学/生猪养殖协同中心，武汉 430070；3.广西扬翔股份有限公司，广西 贵港 537106）

产肠毒素性大肠杆菌（Enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC）属于肠杆菌科埃希氏菌属成员，为革兰氏阴性的直杆菌，无芽孢，有菌毛，主要分为F4（K88）、F5（K99）、F6（987P）和F41四种。肠毒素分为不耐热肠毒素（LT）和耐热肠毒素（ST）两种。在动物中，只有猪源菌株能同时产生LT和ST，其他菌株仅产生ST。ETEC是引起仔猪大肠杆菌性腹泻的最常见的流行病原体，是一类引起人和幼畜（初生仔猪、犊牛、羔羊）腹泻的重要病原菌，初生幼畜被ETEC感染后，常因剧烈水样腹泻和迅速脱水而死亡，发病率和死亡率均很高，给养殖行业带来严重的经济损失。在ETEC众多血清型中，K88血清型流行最为广泛［1，2］。

本研究从湖北省某养猪场采集腹泻猪肠道样品，进行细菌分离鉴定，通过菌落形态、PCR检测等进行鉴定，分离到产肠毒素大肠杆菌，进一步通过耐药性检测，表明分离菌株对阿莫西林、氨苄西林、氟苯尼考、四环素、多西环素、磺胺异恶唑等青霉素类、四环素类、氯霉素类、磺胺类耐药。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 病料 取自湖北省某猪场腹泻仔猪的肠道样品。

1.1.2 试剂 麦康凯琼脂培养基、LB琼脂培养基、LB肉汤培养基等，按常规方法配制。革兰氏染色液、Vazyme 2×Taq Master Mix、DL2000 DNA Maker购自宝生物工程（大连）有限公司；细菌药敏试纸购自杭州微生物试剂有限公司。

1.2 细菌分离纯化培养

用无菌镊子取肠道组织病料，划线接种于麦康凯琼脂培养基中37℃培养18～24 h，挑取单个粉红色疑似菌落继续划线，于麦康凯琼脂培养基中进行纯化培养。

1.3 细菌镜检

参考文献［3］，对疑似菌株进行革兰氏染色，并用光学显微镜进行细菌形态观察。

1.4 分子生物学鉴定

1.4.1 引物合成 所用引物参考刘泽文等［8］合成大肠杆菌PCR引物进行，由擎科生物技术有限公司合成。引物序列如表1所示。

表1 引物序列

1.4.2 可疑菌株DNA提取 挑取可疑菌落接种于LB肉汤中，37℃振荡培养18～24 h。处理菌液，收集上清液作DNA模板，并以大肠杆菌K88株作阳性对照，无菌水作阴性对照。

1.4.3 PCR扩增 参考Vazyme 2×TaqMaster Mix使用说明书。PCR反应程序：94℃预变性3 min；94℃变性30 s；52℃退火30 s；72℃延伸1 min，30个循环；72℃延伸10 min，取适量PCR样品进行琼脂凝胶电泳检测。

1.5 细菌生长曲线

挑取平板上单菌落接种于LB营养肉汤培养基，37℃摇床中培养过夜。将该菌液1∶1 000接种于新鲜培养基，将培养基置于37℃摇床中，每隔1 h取出，吸取100μL，用酶标仪测定OD600nm，设置3个重复，绘制细菌的生长曲线。

1.6 药敏试验

采用K-B药敏纸片扩散法进行细菌药敏试验，挑取单菌落于LB肉汤培养基中，37℃摇床培养过夜。第二天1∶100接种于新鲜培养基中，37℃培养至OD为0.6时，制备细菌悬液，并均匀涂布于LB营养琼脂平板中，将药敏纸片贴于平板表面，重复3个平行，37℃培养18～24 h，测量抑菌圈大小。

2 结果与分析

2.1 分离菌株的培养特性

由图1可知，菌落在麦康凯琼脂培养基上呈现出粉红色圆形菌落、边缘整齐、表面光滑湿润。

图1 分离菌株在麦康凯培养基的培养结果

革兰氏染色镜检显示为单个或成对存在，无芽孢，有菌毛，粉红色的两端钝圆短小杆菌，该细菌为革兰氏阴性杆菌，呈无规则杂乱排列（图2）。

图2 分离菌株的革兰氏染色结果

2.2 PCR鉴定结果

从平板挑取菌落接入LB肉汤培养基中，提取菌株DNA作为模板，分别用大肠杆菌K88、K99、987P引物进行PCR扩增，经1.0%琼脂糖凝胶电泳分析后，分离菌株用K88引物扩增出目的条带，且与预期片段大小相符，其他引物扩增结果均为阴性（图3）。BLAST序列比对结果表明，分离菌株序列与产肠毒素大肠杆菌同源性最高。利用产肠毒素大肠杆菌菌毛保守基因进行了进化树分析，表明分离菌株K88-HB202001与产肠毒素大肠杆菌K88同源性在98.05%～99.51%，表明所分离菌株为产肠毒素大肠杆菌K88，命名为K88-HB202001（图4）。

图3 分离菌株PCR鉴定结果

图4 分离菌株基因进化树

2.3 生长曲线

从图5可以看出，分离株产肠毒素大肠杆菌K88-HB202001在10 h后进入生长平台期，细菌浓度趋于稳定，与对照菌株ETECK88生长趋势一致。

图5 生长曲线结果

2.4 药敏试验结果

对分离菌株进行药敏试验，结果表明，菌株K88-HB202001，敏感药物主要为喹诺酮类、氨基糖苷类、头孢类，占比38%，尤其对环丙沙星、诺氟沙星、卡那霉素、庆大霉素、头孢拉定敏感；中度敏感药物主要是多肽类、硝基呋喃类、氨基糖苷类，占比31%，主要为恩诺沙星、氧氟沙星、新霉素、多粘菌素B、呋喃唑酮等；耐药药物主要为青霉素类、四环素类、氯霉素类、磺胺类，占比31%，主要有阿莫西林、氨苄西林、氟苯尼考、四环素、多西环素、磺胺异恶唑等（表2）。

表2 药敏试验结果

3 小结与讨论

在自然界中，大肠杆菌广泛存在于人和动物肠道、呼吸道以及土壤、水、农产品中，是一类重要的人畜共患病原菌［4-9］。当人或动物机体抵抗力下降或当携带某些毒力因子的大肠杆菌侵入肠道和呼吸道外组织或其他器官时，就会引起感染。其中产肠毒素大肠杆菌是引起新生和断奶仔猪腹泻的最重要的病原之一，所引起的动物腹泻类疾病严重影响畜牧业生产和发展［10-13］。本研究采集临床腹泻仔猪的肠道，通过选择性培养基、菌落形态、革兰氏染色及PCR扩增与测序等方法对细菌进行了鉴定，表明分离菌株为产肠毒素型大肠杆菌K88。

近年来，抗生素的不规范使用，不断有新耐药菌株产生的报道，且多重耐药现象也愈来愈严重，严重危害畜产品安全和人类健康，对中国畜牧业的发展和公共卫生安全造成一定的影响。吴翠蓉等［14］通过对四川、广西、贵州等地区的调查，发现大肠埃希菌呈现出耐药性强、耐药谱广的现象，对四环素的耐药率甚至高达100%，分析可能与四环素类药物在中国使用时间较长、应用范围较广有关。汤景元等［16］对规模养猪场分离的480株大肠杆菌进行19种抗菌药物的药敏试验，50%的菌株耐13种抗生素，14株对19种抗生素全部耐药。于阿芳［17］利用24种常用抗生素对山东省分离的76株大肠杆菌进行了耐药性研究，发现菌株对AM耐药性最强，其次是TE、FFC、KAN、GM，对头孢类药物比较敏感。本研究选用16种常见抗生素对所分离菌株K88-HB202001进行了药物敏感性试验，结果显示分离菌株K88-HB202001对阿莫西林、氨苄西林、氟苯尼考、四环素、多西环素、磺胺异恶唑等青霉素类、四环素类、氯霉素类、磺胺类药物耐药，对环丙沙星、诺氟沙星、卡那霉素、庆大霉素、头孢拉定等喹诺酮类、氨基糖苷类、头孢类药物敏感，为猪场选取精准药物进行疫病治疗提供了依据［18-20］。