韦玥瑞 李科南 张晓东 娜梅拉 娜仁花

(内蒙古农业大学 动物科学学院，呼和浩特 010018)

瘤胃是反刍动物区别于单胃动物最重要的消化器官，也是反刍动物进行有机物厌氧发酵的主要部位。瘤胃中寄居着种类繁多的微生物群被视为由数万亿微生物组成的新器官，其基因含量是宿主细胞的数百倍。在瘤胃微生物的作用下粗纤维降解产生挥发性脂肪酸(VFA)为机体提供能量，而瘤胃微生物还可以利用瘤胃有机发酵产物维持自身的生长繁殖，并为机体提供大量的相对优质的微生物蛋白，从而有助于机体的生长。此外，瘤胃微生物还可以产生维生素，例如维生素B和K。瘤胃微生物具有从头合成维生素B的许多酶，这在人类的胃肠道微生物组中是找不到的。而瘤胃微生物的主要优点是可以利用其他动物不能消化吸收的植物多糖和非蛋白氮转化成自身可利用的营养物质。瘤胃中的微生物包括细菌(10～10个/mL)、古菌(10～10个/mL)、原虫(10～10个/mL)、厌氧真菌(10～10个/mL)、噬菌体(10～10个/mL)。其中细菌数量最多，约为总量的95%，是最主要的功能群落，细菌多样性及群落结构是评价反刍动物瘤胃能否正常发酵常用指标之一。研究表明，许多因素会影响瘤胃细菌群落的组成，其中饲粮类型对反刍动物瘤胃细菌组成有决定性作用。陈丽娟等研究发现以不同比例的构树和苜蓿作为底物进行体外发酵，结果表明，在门水平上高比例构树组可提高瘤胃变形菌门的丰度，高比例苜蓿组提高了广古菌门相对丰度；在属水平上，高比例构树有利于苏特拉菌属和解琥珀酸菌属的增殖，等比例的构树和苜蓿有利于拟杆菌属增殖。徐晓锋等饲喂3周龄左右荷斯坦奶牛不同精粗比的饲粮，发现高精料日粮显著降低了奶牛瘤胃中细菌总数和多样性，抑制纤维分解菌生长。本研究拟采用不同日粮类型饲喂内蒙古绒山羊，通过高通量测序研究不同日粮类型对绒山羊瘤胃细菌多样性的影响，以期为内蒙古绒山羊瘤胃菌群结构的研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物及设计

选择24只健康的8月龄、25 kg左右的内蒙古绒山羊母羊，随机分为4个处理组，分别为：苜蓿组(G1)、苜蓿补饲精料组(G2)、玉米秸秆组(G3)，玉米秸秆补饲精料组(G4)，每组6只母羊。试验期共25天，其中预饲期20 d，正式试验期 5 d。每天在8：00 和17：00饲喂苜蓿和玉米秸，精料补饲时间为17：00，每天每只母羊补饲精料补充料200 g，自由饮水。精料补充料购自某公司，主要成分为玉米、小麦麸、豆粕、磷酸氢钙、石粉和食盐。苜蓿和玉米秸秆均购自当地。饲粮组成及营养水平见表1。

表1 饲粮组成及营养水平(干物质基础)

Table 1 Composition and nutrients levels of diets(DM basis)

项目Item指标Index处理组TreatmentG1G2G3G4w(苜蓿草)/%Alfalfa10075--饲粮组成Compositionofdietw(玉米秸秆)/%Cornstalk--10075w(精料补充料)①/%Concentrate-25-25w(干物质)/%Drymatter95.594.594.493.7总能/(MJ/kg)Grossenergy17.317.116.516.5w(粗蛋白)/%Crudeprotein13.9513.334.526.26营养水平Nutritionallevelw(粗脂肪)/%Etherextract4.043.943.353.43w(中性洗涤纤维)/%Neutraldetergentfiber57.7646.5971.3256.76w(酸性洗涤纤维)/%Aciddetergentfiber41.1131.9542.9233.31w(钙)/%Ca0.620.570.520.50w(磷)/%Phosphorus0.160.210.050.12

注：代表质量分数。G1，苜蓿组；G2，苜蓿补饲精料组；G3，玉米秸秆组；G4，玉米秸秆补饲精料组。下表及图同。

① 精料补充料中粗蛋白质量分数为15.14%，粗脂肪为3.81%，中性洗涤纤维为16.29%，酸性洗涤纤维为5.82%，钙为0.82%，磷为0.42%，食盐为0.3%～2.0%。

Note: representative quality score.G1, alfalfa hay group; G2, alfalfa hay plus concentrate group; G3: cornstalk group; G4,cornstalk plus concentrate group.The same below.

① The nutrient content of concentrate is: crude protein 15.14%, ether extract 3.81%, neutral detergent fiber 16.29%, acid detergent fiber 5.82%, Ca 0.82%, P 0.42%, NaCl 0.3%-2.0%.

1.2 试验样品采集及处理

在正式试验期第5天使用口腔采样器采集24只试验羊的瘤胃液，采集前空腹12 h，每只羊分别采集瘤胃液50 mL，用4层纱布过滤，分装于冻存管内，液氮速冻后放入-80 ℃保存。

1.3 DNA提取及PCR扩增

使用FastDNASPIN Kit for Soil试剂盒提取DNA，使用1%的琼脂糖凝胶电泳检测提取DNA的完整性，用酶标仪检测所提取DNA的纯度及浓度。引物由上海美吉生物医药科技有限公司合成，细菌的引物序列为(F:CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA；R:GCTGCGTTCTTCATCGATGC)。PCR反应体系是20 μL，包括10 ng DNA模板，0.8 μL上游引物，0.8 μL下游引物，4 μL 5×Fastpfu Buffer，2 μL 2.5 mM dNTPs，0.4 μL Fastpfu Polymerase，0.2 μL BSA，补ddHO至20 μL。PCR反应条件为95 ℃预变性3 min，然后进行27个95 ℃变性30 s→55 ℃退火30 s→72 ℃变性45 s 循环，最后72 ℃延伸10 min。

1.4 文库构建及Illumina MiSeq测序

PCR产物使用2%琼脂糖凝胶电泳鉴定并用纯化试剂盒(AxyPrep DNA Gel Extraction Kit)纯化和回收。回收的PCR产物用QuantiFluor-ST进行检测定量，之后按照样本测序量的要求，进行对应比例的混合。使用NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit进行文库构建，采用Illumina MiSeq测序平台进行测序，委托上海美吉生物医药科技有限公司进行测序。

1.5 生物信息学分析

原始数据利用Trimmomatic软件进行质量控制，通过FLASH软件进行序列拼接，利用UPARSE软件对序列进行操作分类单元(operational taxonomic units，OTU)聚类(基于相似度>97%)，用Mothur软件(版本1.30.2)对OTU进行物种注释及丰度统计，在门、科和属分类水平上，统计样品的物种丰度和多样性。利用QIIme(版本1.9.1)软件计算α多样性，包括Chao1指数、Ace指数、Shannon指数和Simpson指数。Chao1指数或Ace指数可反映微生物丰度的大小，Shannon指数或Simpson指数可反映微生物多样性，Coverage可反映物种覆盖度，也是判定测序深度的指标。利用样品中Shannon值与样品中序列数来绘制稀释曲线，以判定样品的测序深度是否达到要求。基于Brary-Curtis样本间距离矩阵对OTU数据进行主坐标分析(Principal co-ordinates analysis, PCoA)可视化图展示β多样性，观察不同饲粮类型组之间微生物群落组成的相似性或差异性。

1.6 统计分析

试验数据经Excel 2016整理，使用SPSS 24软件进行分析，方差分析采用one-way ANOVA，多重比较采用Duncan法。

P

<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 稀释曲线及OTU聚类分析

瘤胃液细菌样品稀释曲线见图1。每组样品的稀释曲线都趋于平缓，说明测序深度及数据量可以覆盖每组样品多数细菌。本试验从24个样品共获得554 688条有效序列，各样品有效序列个数为23 112。基于相似性>97%的原则，共获得1 399个OTU，每个处理组分别有1 298、1 266、1 277、1 223 个OTU，每个组独有的OTU分别有20、3、14和5个。具体OTU个数详见细菌Venn图(图2)。Venn图可以直观的看出不同组之间OTU个数共有和独有的情况。

图2 基于OTU水平的瘤胃细菌Venn图

2.2 α多样性及PCoA聚类分析

饲粮类型对瘤胃细菌α多样性指标的影响见表2。各组间Simpson指数和Shannon指数差异不显著(

P

>0.05)，说明不同饲粮类型条件下瘤胃细菌多样性具有相似性；物种丰度指数Chao1指数为1 090～1 246，Ace指数为1 085～1 235，各组间Chao1指数和Ace指数均差异不显著(

P

>0.05)，说明不同饲粮类型组瘤胃细菌群落的丰富度基本一致。Coverage率均大于99%，说明样品测序合理，可以较好的反映细菌群落结构和多样性。

表2 不同样本的Alpha多样性指数

Table 2 Alpha diversity metrics of different samples

Alpha多样性指数Alphadiversitymetrics处理组TreatmentG1G2G3G4P值P-value香农指数Shannonindex4.65±0.114.82±0.164.31±0.174.60±0.160.17辛普森指数Simpsonindex0.035±0.0030.027±0.0050.058±0.0130.050±0.0120.13Ace指数Aceindex1178±53.151235±56.331085±48.881217±31.600.16Chao1指数Chao1index1177±50.251246±62.871091±41.331223±38.200.15覆盖度Coverage99.06±0.0399.09±0.0699.22±0.0599.10±0.030.10

注：>0.05表示差异不显著。

Note: >0.05 means no significant difference.

图3为瘤胃液样品细菌OTU的PCoA聚类图，不同颜色或形状的点代表不同分组的样本，两样本点越接近，表明两样本物种组成越相似。可知：第1主成分和第2主成分对样本组成差异的贡献率分别为12.78%和10.7%。G1组样品相对于G2、G3和G4组组内差异相对较小，G1组与G3、G4组之间组间差异性较大；整体看，4个处理组组间差异性不大。

每个标记点表示一个样品，同组样品用同一颜色表示。

2.3 饲粮类型对绒山羊瘤胃细菌门、科、属水平上物种组成的影响

2

.

3

.

1

饲粮类型对绒山羊瘤胃细菌门水平的物种组成分析本试验24只绒山羊瘤胃液中细菌共有18个门，26个纲，37个目，59个科，159个属，333个种。表3示出瘤胃细菌门水平相对丰度>1%的菌门。可见：G1、G2、G3和G4组最优势菌门为拟杆菌门(比例72.63%～80.69%)，各组间差异不显著(

P

>0.05)；其次为厚壁菌门(15.00%～23.27%)，各组间差异均不显著(

P

>0.05)；除软壁菌门G2组显著高于(

P

<0.05)其他组外，其他菌门均无显著差异(

P

>0.05)。图4为瘤胃细菌门水平组成热图，可知，G1和G2组聚为一簇，表明G1和G2组的门水平菌群相似性高于其他组。

通过色块颜色梯度展示样本中不同物种的丰度变化情况，右侧为颜色梯度代表的数值，下图同。

表3 瘤胃细菌门水平物种比例

Table 3 Species proportion of rumen bacteria at phylum level

菌门Bacterialcompositionatphylumlevel菌门比例/%PercentofbacterialcompositionatphylumlevelG1G2G3G4P值P-value拟杆菌门Bacteroidetes75.84±2.4874.92±4.2880.69±2.1772.63±5.500.52厚壁菌门Firmicutes18.13±2.3018.68±3.6615.00±1.6923.27±5.770.48髌骨细菌门Patescibacteria2.29±0.822.12±0.530.94±0.221.38±0.430.28螺旋菌门Spirochaetes0.91±0.351.04±0.180.65±0.100.76±0.280.69软壁菌门Tenericutes0.77±0.19ab1.30±0.43a0.41±0.10b0.28±0.07b0.03

注：同行数据字母相同或无字母表示差异不显著(>0.05)，不同小写字母表示差异显著(<0.05)，下表同。

Note: In the same row, values with the same or no letter mean no significant differences(>0.05), and values with different letter mean significant(<0.05).The same below.

2

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3

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2

饲粮类型对绒山羊瘤胃细菌科水平物种组成分析的影响瘤胃细菌科水平相对丰度>1%的物种比例见表4。普雷沃氏菌科(39.50%～50.83%)为G1、G2、G3、G4组科水平的最优势菌，各组间差异不显著(

P

>0.05)，其次为理研菌科(11.93%～22.97%)，各组差异不显著(

P

>0.05)，G1组没有氨基酸球菌科，G1组的毛螺菌科比例显著高于其他3个组(

P

<0.05)，其他菌科差异均不显著(

P

>0.05)。图5为绒山羊瘤胃液细菌科水平的菌群组成热图，G2和G3组聚为一簇，表明G2和G3组的科水平菌群相似性高于其他组。

图5 瘤胃细菌科水平组成热图

表4 瘤胃细菌科水平的物种比例

Table 4 Species proportion of rumen bacteria at family level

菌科Bacterialcompositionatfamilylevel比例/%PercentG1G2G3G4P值P-value普雷沃氏菌科Evotellaceae39.5±5.9349.49±6.9750.83±5.9843.38±7.660.60理研菌科Rikenellaceae22.97±2.7811.93±4.0918.01±3.8818.63±6.540.41F082 5.86±1.2110.34±3.415.80±1.755.11±2.040.36瘤胃球菌科Ruminococcaceae 6.10±1.676.02±1.786.05±0.566.29±0.961.00韦荣氏球菌科Veillonellaceae 4.32±1.837.04±2.942.66±0.448.79±5.600.57毛螺菌科Lachnospiraceae 4.89±0.77a2.36±0.22b2.45±0.39b2.65±0.72b0.02氨基酸球菌科Acidaminococcaceae 01.20±0.381.10±0.722.14±0.940.15克里斯滕菌科Christensenellaceae 1.25±0.600.98±0.170.82±0.201.27±0.260.77

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3

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3

饲粮类型对绒山羊瘤胃细菌属水平物种组成分析瘤胃细菌属水平相对丰度>1%的物种比例见表5。在属水平上，最优势菌属为普雷沃氏菌属(31.76%～42.07%)，各组间差异不显著(

P

>0.05)，其次为理研菌科(11.09%～19.52%)，各组差异不显著(

P

>0.05)，其他菌属各组间差异均不显著(

P

>0.05)。图6为绒山羊瘤胃液细菌属水平上的菌群组成热图，可知，G2和G3组聚为一簇，表明G2和G3组的属水平菌群相似性高于其他组。

表5 瘤胃细菌属水平的物种比例

Table 5 Species proportion of rumen bacteria at genus level

菌属Bacterialcompositionatgenuslevel比例/%PercentofbacterialcompositionG1G2G3G4P值P-value普雷沃氏菌属Prevotella31.76±5.7841.84±5.8342.07±5.7236.15±7.070.59理研菌科_RC9Rikenellaceae_RC9_gut_group19.52±2.4411.09±3.6216.14±3.5817.98±6.030.52F0825.86±1.2110.34±3.415.13±1.785.11±2.040.32奎因氏菌属Quinella3.19±1.975.76±2.750.98±0.326.01±5.840.69普雷沃氏菌科_UCG_003Prevotellaceae_UCG_0032.33±0.703.50±1.403.99±0.623.49±1.050.68普雷沃氏菌科_UCG_001Prevotellaceae_UCG_0011.22±0.462.00±0.432.84±0.952.30±1.320.62瘤胃菌科_UCG_014Ruminococcaceae_UCG_0141.51±1.031.57±0.591.51±0.481.46±0.761.00

图6 瘤胃细菌属水平组成热图

3 讨论与结论

本研究旨在确定不同饲粮类型对内蒙古绒山羊瘤胃细菌多样性及菌群结构的影响。Zhang等以8～10月龄犊牛为研究对象，发现其瘤胃内细菌OTU数目有2 095个。Dias等发现7～63日龄犊牛瘤胃中细菌的OTU个数为1 588。赵娜等发现3月龄宜昌白山羊对照组和试验组瘤胃中细菌的OTU个数为1 002个，其中试验组973个OTU，对照组有988个，2组共享的OTU有959个。杨硕等以不同饲喂方式的大青山绒山羊为研究对象，发现放牧组和放牧加补饲组瘤胃液细菌的OTU数目分别为1 357和1 289个，无显著差异。本研究对内蒙古绒山羊瘤胃液中微生物16S rRNA的V3-V4区进行测序，发现四个组绒山羊瘤胃液样品中细菌OTU数目共有1 399个，各组共享的OTU数目为1 040个，约占总数的74.34%，说明不同饲粮类型条件下瘤胃细菌种类相似，G1、G2、G3和G4组独有的OTU数目分别为20、3、14和5个，说明各组菌群构成同时具有特异性和相似性。本试验的OTU数量低于陈芸对黑山羊的研究结果。这可能与绒山羊的生存环境、地理位置、进化历程有关。此外，本研究显示G2组和G4组瘤胃内细菌Shannon指数高于G1和G3组，Simpson指数则相反，但差异不显著。Shannon指数越高，Simpson指数越低，代表样品中群落多样性越高，说明在补饲精料可增加瘤胃细菌多样性，但结果不显著。Ace指数和Chao1指数越大，说明样品中物种平均丰度越高。本试验中，补饲精料组Ace指数、Chao1指数均高于不补饲精料组，说明在粗饲料为主的饲粮中补饲精料可提高细菌丰度，但结果不显著。苜蓿组的Shannon指数和Ace指数、Chao1指数均高于秸秆组，说明饲喂苜蓿可以提高细菌的多样性及丰度，但结果不显著。陈丽娟等采用体外发酵法研究不同比例的构树和苜蓿混合发酵对瘤胃细菌多样性无影响。赵娜等研究显示，与对照组(全株玉米青贮组)相比，试验组(油菜青贮组)对瘤胃中微生物的种类和丰度无影响。郭凯等研究显示粗蛋白含量为19.1%和22.0%的开食料，对荷斯坦公犊牛门水平和属水平瘤胃优势菌群多样性和丰度无影响。本研究也发现不同饲粮对瘤胃液中优势细菌多样性和丰度无显著影响，究其原因这可能与瘤胃微生物组成受多种因素影响有关，如：动物的遗传因素、生理阶段和健康状况等都会影响瘤胃微生物群落组成。此外，反刍动物为稳定瘤胃内环境，微生物群落一旦建立，一般不容易被改变，但微生物各物种丰度会有所变化。

瘤胃微生物可以降解单胃动物不能消化的粗纤维，并转化成VFA为反刍动物供能，VFA是反刍动物利用能量的主要吸收方式，反刍动物体内70%～80%的能量是由VFA提供。瘤胃细菌群落的结构和多样性受动物品种、日龄、生理状态、饲粮类型及饲养管理等因素的影响而改变，其中饲粮类型对瘤胃细菌群落的多样性和结构的影响在各种因素中往往占据主要地位。Yez等发现未断奶羔羊饲喂精粗料混合饲粮比仅喂粗料的瘤胃细菌数量高，产琥珀酸丝状杆菌与产甲烷菌数量都减少，说明其瘤胃内的微生物菌群受饲粮类型的影响。王尧悦等研究发现与日龄相比，饲粮对瘤胃微生物数量影响更大。本试验通过研究不同饲粮类型对内蒙古绒山羊瘤胃细菌多样性及菌群结构的影响，显示各处理组在门水平的最优势菌为拟杆菌门(72.63%～80.69%)，次优势菌为厚壁菌门(15%～23.27%)，其他菌门比例很低，这与大多数研究结果一致。研究表明拟杆菌门与反刍动物瘤胃中非纤维多糖降解密切相关，是主要的非纤维性碳水化合物和蛋白质的主要分解菌。厚壁菌门是降解纤维主要的分解菌，可将纤维降解为VFA为反刍动物供能。张年等研究湖北黑头羊饲喂不同饲粮条件下瘤胃细菌多样性及菌群结构的变化，结果表明在门水平优势菌门为拟杆菌门、厚壁菌门。张冬强通过饲喂波尔山羊母羊不同粗饲料比例的饲粮发现，不同水平苜蓿粉对母羊瘤胃微生物群落结构产生了一定的影响，但各个处理组拟杆菌门和厚壁菌门还是优势菌门。Pitta等发现不同含量干草也影响瘤胃内细菌菌群，百分之百的干草组菌群丰富度最高，拟杆菌门为优势菌门。王继文等给波尔山羊饲喂粗精比70∶30饲粮，研究得出拟杆菌门相对丰度最高，然后是厚壁菌门。本试验结果显示，G1组、G2组、G3组、G4组的最优势菌门均为拟杆菌门，丰度分别为75.84%、74.92%、80.69%、72.63%；其次为厚壁菌门，四个组分别是18.13%、18.68%、15.00%、23.27%。在饲喂苜蓿的基础上补饲精料后厚壁菌门丰度无变化，在饲喂玉米秸秆的基础上补饲精料后厚壁菌门丰度增加。可能是劣质粗料补饲营养价值高的精料对厚壁菌门的丰度影响会更加明显。此外，本研究还发现G2组软壁菌门丰度显著高于其余3个组，但由于软壁菌门在瘤胃中不属于优势菌门，有关软壁菌门的报道也较少，所以G2组软壁菌门丰度显著高于其余3个组的具体原因还需更深入的研究。在科水平上，普雷沃氏菌科(39.5%～50.83%)为各组绒山羊瘤胃内最优势菌，普雷沃氏菌科与蛋白质、碳水化合物和纤维消化密切相关。本研究还发现G1组毛螺旋菌科显著高于G2、G3和G4组。有报道称，饲喂富含果胶的豆科牧草能促进毛螺旋菌科的繁殖，因此，猜测可能是苜蓿中富含果胶使毛螺旋菌科丰度显著高于其他3组。在属水平上，绒山羊瘤胃中拟杆菌门的普雷沃氏菌属(31.76%～42.07%)占绝对优势。Pitta等对牛瘤胃液研究发现其细菌群落中最优势菌属为普氏菌属。曾燕等和吴琼等采用高通量测序技术测定蒙古羊和安格斯牛瘤胃液菌群多样性，同样发现普雷沃氏菌属为最优势菌属。普雷沃氏菌属在大部分反刍动物瘤胃中是丰度最高的菌属，普雷沃氏菌属对半纤维素、非纤维性碳水化合物、蛋白质降解等方面发挥重要的作用。此外，普雷沃氏菌对植物细胞壁也具有降解作用。在本试验中玉米秸秆因含有较多的粗纤维，所以玉米秸秆组的普氏菌属丰度比苜蓿组高，但差异不显著。

本研究通过饲喂不同类型的饲粮，利用基于16S rRNA高通量测序技术检测内蒙古绒山羊瘤胃液样本，结果表明：在不同饲粮条件下，内蒙古绒山羊瘤胃最优势菌门为拟杆菌门，最优势菌科是普雷沃氏菌科，最优势菌属是普雷沃氏菌属；不同饲粮类型对内蒙古绒山羊瘤胃液细菌多样性无明显影响。