刘 雨,王会会,赵建辉,姜明星

(1.华北制药华胜有限公司,河北 石家庄 052165;2.华北制药集团新药研究开发有限责任公司,河北 石家庄 052165)

免疫抑制剂被广泛应用于器官移植及自身免疫性疾病的治疗中,环孢菌素A作为第一代特异性抑制T淋巴细胞免疫的免疫抑制剂在临床上应用广泛[1-2]。近年来,随着环孢菌素A对炎性因子药理学活性的发现,环孢菌素A也被用于治疗过敏性皮肤炎、类风湿性关节炎和传染性疾病等[3-5]。除环孢菌素A的制备、剂型及临床应用一直是被关注的热点外,环孢菌素A的工业化生产的产量和质量也是国内外该领域研究的热点[6-7]。目前,国内环孢菌素A的生产工艺中普遍存在环孢菌素A发酵效价低,发酵培养基成本高的问题,不利于企业的竞争和发展[8]。

环孢菌素A是由11个氨基酸组成的环形多肽[9],其合成酶缺乏特异性[10]。赵德修[11]研究发现环孢菌素A的生物合成路线受添加外源氨基酸的影响,通过在发酵底物中加入氨基酸可以调控环孢菌素中A,C和D等组分所占比例来提高有效产物环孢菌素A的合成量,这些氨基酸具有前体或诱导物的作用,在发酵过程中影响环孢菌素A的产生;吴恩国等[12]研究发现前体氨基酸的添加对多黏菌素B发酵过程中的组分和杂质都有调节作用;沈天丰等[13]研究了补加前体氨基酸对酿酒酵母SAM-J5E-4发酵生产S-腺苷-L-蛋氨酸的影响。环孢菌素A产生菌雪白白僵菌属于丝状真菌[14],在传统的简单分批发酵过程中,培养基营养丰富,发酵液比较黏稠,前期菌丝生长缓慢,产物合成较慢;后期菌丝快速生长,导致溶氧不足及养分匮乏,菌丝自溶加速,发酵周期短,单位菌体合成环孢菌素A的能力不高[15]。闫同顺等[16]通过降低初始培养基中的果糖比例和流加补糖,使50 L发酵罐中环孢菌素A的质量浓度达到6.0 g/L。笔者选取6种氨基酸作为前体物质,通过实验确定了L-缬氨酸的最佳添加时间和添加量,提高了环孢菌素A的发酵效价。研究降低了发酵配方中主要碳源糊精的初始质量浓度,采用补料发酵方式,在发酵过程中补加葡萄糖,维持了菌丝的生长状态,延长了发酵周期,大大提高了单位菌体合成产物的能力,有利于降低成本,应用于规模化生产后,进一步提高了企业的竞争力。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 出发菌株

雪白白僵菌(NC18-462),华北制药华胜公司保藏。

1.1.2 培 养 基

种子培养基:糊精20 g/L,葡萄糖5 g/L,液体玉米浆15 g/L,磷酸二氢铵2 g/L,硫酸镁0.5 g/L,pH 6.0。

发酵培养基:糊精100 g/L,葡萄糖20 g/L,玉米浆干粉30 g/L,酵母粉5 g/L,磷酸二氢铵5 g/L,硫酸镁1 g/L,氯化钾0.5 g/L,pH 6.0。

各氨基酸均配制成质量分数为5%的储备液,根据需要按比例向发酵培养基中加入不同体积的储备液。

1.2 方 法

1.2.1 培养条件

1) 摇瓶培养

将培养10 d的斜面以挖块形式接种于装有40 mL种子培养基的250 mL三角瓶中,25 ℃,220 r/min振荡培养48 h,然后以体积分数5%的接种量接入装有40 mL发酵培养基的250 mL三角瓶中,25 ℃,220 r/min振荡培养7 d,放瓶检测。

2) 200 L实验罐发酵培养

采用两级发酵,种子瓶以体积分数0.5%接种量接种至30 L种子培养基中,25 ℃,搅拌转速350 r/min,通气比为V(培养液)∶V(无菌空气)=1∶1,培养48 h,然后以体积分数10%的接种量接种至150 L发酵培养基中,搅拌转速为600 r/min,通气比为V(培养液)∶V(无菌空气)=1∶1.5,培养8 d放罐。

发酵过程中,氨基酸配制成质量分数为5%的储备液一次性补入;补料糖配制成400 g/L的补液以流加方式加入。

1.2.2 发酵液菌体生物量及发酵效价的测定

1) 菌体生物量测定

离心法[17]测定:准确吸取10 mL发酵液, 3 000 r/min离心10 min,读取上清液体积V1,则菌体生物量V为

V=(10-V1)/10×100%

(1)

2) 发酵效价测定

取10～20 mL的发酵液,加入2.5倍体积的工业乙醇(体积分数≥95%)搅拌浸泡1 h,离心,取上清液,用50%工业乙醇洗滤饼2～3次,用50%工业乙醇稀释,微孔滤膜滤后进行HPLC检测。

3) HPLC检测条件

高效液相色谱仪,Agilent 1260;色谱柱,Ultimate Welchrom C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相为V(乙腈)∶V(磷酸水)=70∶30,其中磷酸水pH为2.5;流速1.0 mL/min;检测波长214 nm;柱温70 ℃。

2 结果与讨论

2.1 不同氨基酸对环孢菌素A发酵的影响

选取环孢菌素A分子组成中的6种氨基酸,分别以质量分数0.5%的比例加入发酵培养基中,同时以不加任何氨基酸的发酵培养基作为对照进行发酵培养。每个实验组设置3个平行以获取平均值,测定发酵效价和菌体生物量,考察不同氨基酸对环孢菌素A发酵的影响。以对照组效价和菌体生物量为100%,计算每实验组的相对效价和相对菌体生物量,结果如表1所示。

表1 不同氨基酸对环孢菌素A的影响

由表1可知:除加入甘氨酸降低发酵效价外,其余氨基酸的添加均能不同程度地提高环孢菌素A的发酵效价,其中L-缬氨酸和L-天冬酰胺效果明显,分别提高了57.2%,38.5%。氨基酸的添加均能提高菌体生物量。L-缬氨酸虽然可以明显提高环孢菌素A的发酵效价,但DL-缬氨酸对产物形成无明显促进作用,说明L-缬氨酸具有引入环孢菌素A分子的特异性,而DL-缬氨酸则无此作用。

2.2 氨基酸添加量和添加时间对环孢菌素A的影响

进一步考察氨基酸的添加时间和添加量对环孢菌素A的影响。将明显促进产物合成的L-缬氨酸和L-天冬酰胺分别以质量分数0.2%,0.4%,0.6%,0.8%的比例加入发酵培养基,以不加氨基酸的发酵培养基作为对照进行发酵培养,考察氨基酸不同添加量对环孢菌素A发酵的影响。以对照组效价和菌体生物量为100%,计算每实验组的相对效价和相对菌体生物量,结果如表2,3所示。

表2 不同L-缬氨酸质量分数对环孢菌素A的影响

表3 不同L-天冬酰胺质量分数对环孢菌素A的影响

由表2,3可知:当L-缬氨酸和L-天冬酰胺添加质量分数分别为0.6%和0.4%时,发酵效价最高,与不加氨基酸的对照相比分别提高65.5%和52.7%。添加L-缬氨酸时,菌体生物量增加明显,放瓶时较对照提高32.4%,可见添加L-缬氨酸可以有效减缓菌丝自溶,有利于发酵的进行。因此,笔者确定了L-缬氨酸为最佳的前体氨基酸,最适添加质量分数为0.6%。

在发酵0,24,48,72,96 h时分别加入质量分数为0.6%的L-缬氨酸,考察氨基酸的添加时间不同对环孢菌素A发酵过程中菌体生物量的影响。以10 d放瓶时效价为100%,计算发酵过程中的相对效价,考察氨基酸的不同添加时间对发酵效价增长趋势的影响,结果如表4,5所示。

表4 不同添加时间对菌体生物量的影响

表5 不同添加时间对发酵效价的影响

由表4,5可知:L-缬氨酸添加时间越早,菌丝前期生长越快,但后期菌丝生长能力不足,其原因可能是氨基酸在发酵前期被作为碳源或氮源消耗掉一部分;L-缬氨酸添加时间越晚,菌丝前期生长越慢,发酵结束时菌体生物量也不高,其原因可能是氨基酸的诱导作用没有充分发挥。

在发酵24 h添加L-缬氨酸,放瓶菌体生物量最高,达到52%,发酵效价也最高,说明在菌丝的对数生长期添加前体物质,能够很好地刺激菌丝生长和次级代谢,提高菌丝生长能力,加快合成产物速度,结果如图1所示。在发酵24 h时添加L-缬氨酸,菌丝快速生长合成环孢菌素A,发酵效价呈直线上升趋势。由表4,5及图1可知:L-缬氨酸的最佳添加时间为发酵开始后24 h。

图1 24 h添加L-缬氨酸的发酵趋势图Fig.1 Diagram of fermentation trend of adding L-valine at 24 h

2.3 补料对环孢菌素A发酵的影响

环孢菌素A是胞内产物,发酵过程中菌体生物量大,所需培养基营养丰富,糊精作为不可替代的碳源,初始添加质量分数高达10%,培养基十分黏稠,容易导致灭菌不彻底,造成染菌的后果。培养基中糊精质量分数高,阻碍了溶氧传递,使得前期菌丝生长缓慢。因此,减少发酵过程中糊精的使用量,对提高环孢菌素A的发酵水平和碳源的转化率,降低发酵成本有重要意义。

笔者通过降低发酵培养基中初始糊精比例,在发酵过程中补加葡萄糖的方式考察补料分批发酵方式对菌体生物量和发酵效价的影响。据以往经验,发酵液中残糖质量浓度≤40 g/L时,发酵效价增长迅速,将初始糊精质量分数分别降为6%,4%,通过流加葡萄糖将残糖分别维持在40,20 g/L,不同补料方式对环孢菌素A发酵的影响如图2所示。

1—糊精4%,残糖40 g/L;2—糊精4%,残糖20 g/L;3—糊精6%,残糖40 g/L;4—糊精6%,残糖20 g/L。图2 补料对环孢菌素A发酵的影响Fig.2 Effects of feeding on the fermentation of cyclosporin A

由图2可知:当糊精的初始质量分数为6%,通过流加葡萄糖控制发酵液中残糖质量浓度为20 g/L时,前4天发酵效价增长缓慢,从第5天开始,产物合成迅速加快,发酵效价呈直线上升趋势,至第10天放罐时达到14.025 mg/mL。

2.4 200 L试验罐发酵验证

将优化后的发酵工艺在200 L发酵罐中进行试验,采用2级发酵,按照1.2.1节实验进行发酵培养。初始培养基糊精质量分数为6%,发酵过程中当残糖质量浓度低于40 g/L时,开始流加葡萄糖,维持残糖质量分数约20 g/L,且发酵24 h时一次性补入质量分数0.6%的L-缬氨酸,培养10 d后放罐。发酵过程中菌体生物量和发酵效价变化趋势如图3所示。

图3 200 L发酵罐发酵趋势图Fig.3 Diagram of fermentation trend in 100 L fermentor

通过在200 L发酵罐验证实验,放罐时菌体生物量达到54%,发酵效价达到15.414 mg/mL较原工艺提高28%。

3 结 论

选取6种氨基酸作为前体物质添加到环孢菌素发酵培养基中,发现L-缬氨酸和L-天冬酰胺能明显提高发酵效价。研究了这2种氨基酸的添加时间、添加量对环孢菌素A发酵的影响,确定了L-缬氨酸为前体物质,其最佳添加量为质量分数0.6%,添加时间为发酵24 h时一次性补入;优化了环孢菌素A的发酵培养基,将简单分批发酵改为补料分批发酵,降低培养基中糊精的添加量,发酵过程中通过流加葡萄糖来维持残糖质量浓度。优化后的发酵工艺更有利于菌丝生长,发酵效价较原工艺提高28%,200 L实验罐放罐效价达15.414 mg/mL,为工业化生产提供数据依据。