朱勇琳， 王绿娅， 鄢盛恺

（1.遵义医科大学附属医院检验科，贵州 遵义 563003；2.首都医科大学附属北京安贞医院，北京 100029）

低密度脂蛋白受体（low-density lipoprotein receptor，LDLR）是机体清除血浆低密度脂蛋白（low-density lipoprotein，LDL）的关键受体，在维持体内胆固醇代谢平衡方面具有重要作用[1-2]。LDLR基因突变可致多种脂代谢紊乱性疾病，最典型的是家族性高胆固醇血症（familial hypercholesterolemia，FH），其最主要的临床表现是低密度脂蛋白胆固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）升高、黄色瘤、角膜弓和早发动脉粥样硬化性心血管疾病（atherosclerotic cardiovascular disease，ASCVD）。本文对LDLR基因突变和功能的检测方法与临床应用进展进行综述，以期能为脂代谢异常及FH患者的早期筛查与诊治提供新思路。

1 LDLR基因的结构和功能

LDLR基因位于人类第19号染色体（p13.1-13.3），全长45 kb，包含18个外显子和17个内含子。LDLR在肝脏中分布最多，主要功能是清除血浆LDL，维持体内胆固醇代谢平衡[1-2]。LDLR基因表达在转录水平和转录后分别受肝脏X受体（liver X receptor，LXR）和前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶Kexin-9（proprotein convertase subtilisin/Kexin type 9，PCSK9）的调控，同时也受转录因子胆固醇调节元件结合蛋白2（sterol-regulatory element binding protein-2，SREBP-2）的调控[3-4]。LDLR与LDL在细胞表面结合成复合物并转运到核内体，释放出LDL后又返回细胞膜继续转运[1]。LDLR缺乏会导致体内LDL代谢受阻，继而引发FH，这是开发他汀类药物等调脂药物的理论基础。ABIFADEL等[5]发现，PCSK9可降解LDLR，进而导致高胆固醇血症，这为研制PCSK9抑制剂提供了思路。纯合型家族性高胆固醇血症（homozygous familial hypercholesterolemia，HoFH）是由LDLR基因的双等位基因突变引起的，危害更大，且他汀类药物和PCSK9抑制剂对其治疗效果有限。近年来，国外研发出的血管生成素样蛋白3（angiopoietin-like protein 3，ANGPTL3）抑制剂，具有不依赖LDLR降低血浆LDL-C的特点，可使HoFH患者的LDL-C降低50.9%～90.2%[6-7]。

2 LDLR基因突变的检测方法与临床应用

2.1 LDLR基因突变的检测方法

LDLR基因突变的检测以往多采用Southern印迹法、原位荧光杂交法、脉冲场凝胶电泳法、逆转录-聚合酶链反应、变性梯度凝胶电泳和单链构象多态性等方法[8]。近年来，Sanger测序（一代测序）、二代测序（next generation sequencing，NGS）和多重连接依赖性探针扩增（multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA）等技术成为检测LDLR基因突变的主流方法，其优缺点及应用示例见表1[9]。LDLR基因突变的致病性可在LOVD、ClinVar和PubMed等数据库中查询[10]，如查询不到，则可能为新的突变，可用Sorting Tolerant From Intolerant（SIFT）、PolyPhen-2、FruitFly、Dann和The Combined Annotation Dependent Depletion（CADD）等工具评估新突变的致病性及有害性[11-12]。

表1 3种常用LDLR基因突变检测方法的优缺点及其应用

2.2 LDLR基因突变检测的临床应用

LDLR基因突变检测是FH诊断的金标准[14]。目前报道的LDLR基因突变多达3 050个（来源于ClinVar数据库），其中第4外显子上的突变最为多见，突变频率较高的位点有助于FH筛查[15]，部分突变的位点见图1。LDLR基因致病性突变可致相应的氨基酸结构改变，并导致LDLR功能改变，从而影响胆固醇代谢及LDL的清除，最终引发FH，由其突变导致的FH病例，占所有报道病例的90%以上[14-15]。目前，FH的诊断率为28%～80%，单以临床症状进行诊断的效能有限，有90%以上的患者未得到有效的诊断和治疗[15-16]。《家族性高胆固醇血症筛查与诊治中国专家共识》认为FH的诊断应结合临床症状和基因检测[14]。同时，也应注意基因检测结果与临床诊断之间可能存在不一致的情况[17]，特别是植物固醇血症患者临床症状与部分HoFH患者相似，可通过检测血浆植物固醇水平及三磷酸腺苷结合盒转运蛋白（adenosine triphosphatebinding cassette，ABC）G5或ABCG8基因突变加以鉴别[18]。

LDLR基因突变检测也有助于评估ASCVD风险以及基因变异类型对ASCVD的影响程度。有研究发现，在同等LDL-C水平下，致病性突变携带者ASCVD发生风险高于非携带者[19]。TRINDER等[20]通过一项大样本高胆固醇血症队列（277例单基因FH、379例多基因FH）评估基因变异对ASCVD发生风险的影响，发现遗传因素增加ASCVD发生风险程度由强到弱依次为单基因变异FH患者、多基因变异FH患者、无变异患者。

图1 部分LDLR基因突变位点与突变类型示意图

此外，LDLR基因检测还有助于血脂异常患者的治疗决策与综合管理。有研究发现，LDLR基因检测对调脂治疗的启动、依从性和更有效降低LDL-C等均有积极作用[16]。LDLR基因检测可明确FH患者的基因型，不同基因型患者的预后不尽相同，且级联筛查的模式和临床治疗方案的选择也有很大差别，这有助于对患者进行个体化精准治疗。未及时治疗的FH患儿成年后发生冠状动脉事件的风险更高[21]，而儿童期被及时诊断和适当治疗的FH患儿预期寿命有望达到同龄儿童正常水平，经明确诊断和适当治疗的成年FH患者也可显著降低早发冠心病的风险[22]。

3 LDLR功能的检测方法与临床应用

3.1 LDLR功能的检测方法

LDLR的功能主要是清除血浆LDL[1]，研究整个LDLR周期（包括LDLR的表达和LDLR与LDL的结合）可全面反映LDLR的功能。目前，常用的方法包括荧光分析法和放射性分析法，2种方法的比较见表2。因荧光标记LDL是一种更安全且等效的方法，所以放射性分析法正逐渐被荧光分析法取代[2，15]。检测仪器主要有流式细胞仪（fluorescence-activated cell sorting，FACS）、共聚焦激光扫描显微镜（confocal laser scanning microscope，CLSM）等。此外，体外细胞模型可用于研究LDLR基因突变、功能及致病机制，如中国仓鼠卵巢细胞系CHO-ldlA7不表达内在LDLR，是研究LDLR功能的优秀模型[7]。

表2 荧光分析法和放射性分析法比较

3.1.1 荧光分析法 （1）荧光分析法检测LDLR的表达主要有3种方法。第1种为抗体标记法，用荧光标记IgG-C7，利用FACS检测细胞荧光强度，可反映LDLR的表达量。IgG-C7是LDLR的单克隆抗体，可定量检测LDLR的数量[23]；第2种为间接免疫荧光法，将LDLR基因突变质粒转染的CHO-ldlA7细胞、LDLR抗体和荧光二抗共同孵育后，使用FACS定量检测荧光强度来反映LDLR的表达量[7]；第3种为免疫印迹法，将LDLR基因突变质粒转染的CHO-ldlA7细胞、LDLR抗体、抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗体和荧光二抗共同孵育后，量化LDLR蛋白的相对条带强度，可用于半定量分析CHO-ldlA7细胞中成熟LDLR的表达量[15]。（2）荧光分析法检测LDLR与LDL结合的能力主要有2种方法。第1种为FACS检测法，用荧光标记LDL，与LDLR抗体和荧光二抗共同孵育后，通过FACS测定荧光强度，总荧光强度对应细胞内摄取LDL的量，可反映LDLR结合LDL的能力。加入台盼蓝，可抑制细胞外部荧光，能更准确地检测LDLR结合LDL的量[7，24]；第2种为CLSM检测法，采用荧光标记LDL，与LDLR基因突变质粒转染的CHO-ldlA7细胞共同培养，通过CLSM观察LDLR与LDL的结合。使用CLSM和软件分析能直观地观察细胞，并进行图像处理和荧光强度量化[7]。

3.1.2 放射性分析法 （1）LDLR表达的检测。将125I标记的IgG-C7与LDLR共同孵育，通过化学发光法检测细胞的放射性，可反映LDLR的表达量[23]。（2）LDLR与LDL结合能力的检测。将125I标记到LDL上，悬浮在肝素溶液中，通过化学发光法检测肝素的放射性，可反映细胞内LDLR结合125I-LDL的能力[25]。

3.2 LDLR功能检测的临床应用

LDLR功能检测有助于LDLR基因突变的分类。目前报道的LDLR基因突变中，仅有约15%的LDLR基因突变进行了功能研究[15]。因没有标准化的突变分类方法[26]，根据美国医学遗传学和基因组学学会的标准，FH患者中有约50%的相关突变归为意义未知的突变[27]。只有当突变对LDLR活性及LDL清除有影响时才会被定义为致病突变。LDLR基因突变分类是FH诊断的一部分，只有可能致病和致病突变是临床诊断的依据。为了能更好地诊治FH患者，根据LDLR功能来分类突变势在必行[15]。

LDLR功能检测有助于评估LDLR基因突变的致病性。不同类型的LDLR基因突变后受体活性为正常受体活性的2%～80%[7]，80%～100%是正常的受体活性，低于80%与受体活性降低（缺陷突变）相关，低于2%与没有受体活性（“零”突变）相关[15]，活性越低后果越严重。在大多数FH类型中，LDLR基因突变会导致LDLR功能降低，但近期BJORNSSON等[28]报道的LDLR基因3′非翻译区中的del2.5突变，是目前仅有的一处LDLR功能增益型突变。目前认为，LDLR基因最严重的突变是位于第10外显子上的（1448G＞A，p.Trp483X）突变，即第1448位碱基由G突变为A，终止密码子提前出现，蛋白质翻译提前终止，导致氨基酸链缩短和蛋白质分子不完全形成[29]。功能分析表明，W483X突变可导致LDLR结合活性降低17%，LDLR内化活性降低39%，降低了LDLR清除体内LDL的效率，这是我国南方FH患者和我国普通人群中最常见的致病突变[12，30]。

LDLR功能检测有助于指导FH患者的治疗。不同基因突变的FH患者治疗方式不尽相同，随着不同的调脂药物的应用，通过LDLR功能研究可了解LDLR活性及治疗效果，有针对性地选用合适的药物或其他方法进行调脂治疗，以降低ASCVD的发生风险，有助于FH患者的综合管理[11，15]。如HoFH患者不能合成LDLR，对调脂药物治疗的反应性不好，不经治疗在30岁之前就可能会发生心肌梗死；杂合型家族性高胆固醇血症（heterozygous familial hypercholesterolemia，HeFH）患者症状较轻，对调脂药物表现出更好的治疗反应[30]。

4 展望

近年来，越来越多的国家开始重视FH，但因没有公认的诊断标准、适用于各级实验室的检测手段，加之临床医生认知与重视度不够等原因，导致不能及时、有效地筛查出LDLR基因的致病性突变，FH漏诊严重，这一现象在发展中国家，特别是经济欠发达地区尤为突出。同时，现有的用于治疗FH的一线药物也具有一定的局限性，如需联合他汀类药物与PCSK9抑制剂等昂贵药物同时治疗，常常导致有些FH患者单靠药物治疗并不能达到预期效果。因此，开发价廉、更快、更准确、不需特殊设备且适用于基层实验室开展的检测方法和商品化检测试剂非常必要，有助于发现LDLR新的基因突变及潜在的调脂治疗靶点，研制出疗效更好的调脂药物；也有助于早期高效筛查ASCVD及FH高危人群，以实现早诊断、早治疗。同时，还应进一步加强临床及全社会对FH的危害性和ASCVD早期干预重要性的认识与关注，以帮助防治ASCVD。