樊明鹤， 林广民， 黄瑞杰

（漯河市中心医院检验科，河南 漯河 462000）

缺血性脑血管病（ischemic cerebrovascular disease，ICVD）是一类由供血功能障碍所致的脑组织坏死或功能丧失的脑血管疾病，患者因缺血、缺氧而出现不同程度的脑功能损伤，进而对认知功能、神经功能等造成负面影响[1]。流行病学调查结果显示，ICVD占脑血管疾病的65%～85%，且发生率呈不断上升趋势[2-3]。动脉粥样硬化是ICVD发生的主要原因，而炎性反应及氧化应激是导致动脉粥样硬化的2个主要机制[4]。血红素氧合酶1（heme oxygenase-1，HO-1）是血红素降解过程中的限速酶，在体内发挥抗炎、抗氧化、抗凋亡等作用[5-6]。Toll样受体（Toll-like receptor，TLR）是病原体相关分子模式识别受体，在先天免疫系统中发挥重要作用，并与动脉粥样硬化的发生、发展密切相关，在动脉粥样硬化易损斑块的形成中起重要作用[7]。目前，关于HO-1及TLR4在评估ICVD患者预后中的报道较少见。因此，本研究拟通过探讨TLR4 mRNA和HO-1水平在ICVD预后中的作用，为ICVD的治疗及预后评估提供相关依据。

1 材料和方法

1.1 研究对象

选取2016年2月—2019年12月漯河市中心医院收治的324例ICVD患者（ICVD组），其中男190例、女134例，年龄（51.5±4.1）岁。选取同期漯河市中心医院健康体检者324名作为正常对照组，其中男195名，女129名，年龄（51.1±4.8）岁。2个组之间年龄、性别差异均无统计学意义（P＞0.05）。本研究经漯河市中心医院伦理委员会批准，所有对象均知情同意。

1.2 纳入及排除标准

ICVD组纳入标准：（1）符合全国第4届脑血管病学术会议制定的ICVD相关标准[8]；（2）首次发病且发病至入院时间≤24 h；（3）年龄≥18岁。

正常对照组纳入标准：（1）近1个月内体检结果显示无脑血管病；（2）年龄≥18岁。

ICVD组及正常对照组排除标准：（1）合并恶性肿瘤；（2）并发心脏疾病并可能会导致脑栓塞；（3）并发严重认知功能障碍；（4）近1个月内发生感染性疾病或感染症状；（5）近3个月内服用过抗菌药物、激素、免疫抑制剂等可能影响实验结果的药物；（6）合并其他严重疾病。

1.3 方法

1.3.1 样本采集及检测 采集ICVD患者入院当天、正常对照者体检当天静脉血6 mL，分为2管。1管1 007×g离心5 min，分离血清，采用酶联免疫吸附试验检测HO-1水平，试剂盒购自南京博研生物科技有限公司[灵敏度为＜5 pg/mL、检测范围为156～10 000 pg/mL，批内变异系数（coefficient of variation，CV）＜9%，批间CV＜11%，标准曲线r=0.990]，检测仪器为TECAN多功能酶标仪（瑞士帝肯公司）。另1管用于检测外周血TLR4 mRNA。采用RNA提取试剂盒（上海泽叶生物科技有限公司）提取外周全血RNA，采用逆转录试剂盒（货号RR046A，日本Takara公司）进行逆转录反应，采用SYBR RT-PCR试剂盒（货号BSB22，杭州博日科技有限公司）进行逆转录聚合酶链反应。反应条件：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s，35个循环。以β-actin为内参，采用2-△△Ct法测定TLR4和β-actin基因的相对表达量。每份样本重复检测3次，取均值。引物由北京鼎国生物科技有限公司合成，引物序列见表1。

1.3.2 头颅多普勒超声 对ICVD患者进行头颅多普勒超声检查，并根据超声结果进行分组。轻度狭窄组最大流速100～139 cm/s，声频、血流信号无明显改变；中度狭窄组最大流速140～179 cm/s，血流信号表现为典型束腰状，夹杂低频杂音；重度狭窄组最大流速≥180 cm/s，声频信号呈波峰圆润，血流信号发生色彩翻转。

1.3.3 美国国立卫生研究院卒中量表（the National Institutes of Health Stroke Scale，NIHSS）评分[9]采用NIHSS评分评估ICVD患者的神经功能缺损程度，并分组。轻度损伤组NIHSS评分≤4分，中度损伤组NIHSS评分为4～20分，重度损伤组NIHSS评分＞20分。

1.3.4 随访 对ICVD患者随访6个月，依据改良Rankin量表（modified Rankin scale，MRS）[10]的得分情况及并发症（认知功能障碍、癫痫发作、肺部感染等）发生情况进行分组。预后较好组MRS评分为0～2分，未出现并发症；预后不良组MRS＞2分或出现并发症。

1.4 统计学方法

采用SPSS 20.0软件进行统计分析。呈正态分布的数据以±s表示，2个组之间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。计数资料以例或率表示，组间比较采用χ2检验。采用Pearson相关分析评估HO-1及TLR4 mRNA与NIHSS评分的相关性，采用Spearman相关分析评估HO-1及TLR4 mRNA与颅动脉狭窄程度的相关性。采用受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线评估HO-1及TLR4 mRNA判断ICVD预后的价值。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ICVD组与正常对照组一般资料比较

ICVD组与正常对照组之间吸烟史、饮酒史、高血压史、糖尿病史、心脏疾病史、高脂血症比例差异均有统计学意义（P＜0.001）。见表2。

表2 ICVD组与正常对照组一般资料比较 例

2.2 ICVD组与正常对照组HO-1水平及TLR4 mRNA相对表达量的比较

ICVD组HO-1水平及TLR4 mRNA相对表达量均高于正常对照组（P=0.000）。见表3。

表3 ICVD组与正常对照组HO-1水平及TLR4 mRNA相对表达量的比较 ±s

表3 ICVD组与正常对照组HO-1水平及TLR4 mRNA相对表达量的比较 ±s

注：空白表示无此项。

组别 例数 HO-1/（ng/mL） TLR4 mRNA ICVD组 324 4.18±2.52 1.21±0.57正常对照组 324 2.10±1.11 0.31±0.10 t值 10.369 27.994 P值 0.000 0.000

2.3 不同狭窄程度ICVD患者HO-1水平及TLR4 mRNA相对表达量的比较

轻度狭窄组、中度狭窄组及重度狭窄组HO-1水平及TLR4 mRNA相对表达量依次升高，各组间差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表4。

表4 不同狭窄程度ICVD患者HO-1水平及TLR4 mRNA相对表达量的比较 ±s

表4 不同狭窄程度ICVD患者HO-1水平及TLR4 mRNA相对表达量的比较 ±s

注：与轻度狭窄组比较，*P＜0.05；与中度狭窄组比较，#P＜0.05；空白表示无此项。

组别 例数 HO-1/（ng/mL） TLR4 mRNA轻度狭窄组 93 3.06±1.80 0.87±0.41中度狭窄组 152 4.11±2.32* 1.11±0.50*重度狭窄组 79 5.89±2.19*# 1.36±0.44*#F值 56.836 22.012 P值 0.000 0.000

2.4 不同神经功能损伤程度ICVD患者HO-1水平及TLR4 mRNA相对表达量的比较

轻度损伤组、中度损伤组及重度损伤组HO-1水平及TLR4 mRNA相对表达量依次升高，各组间差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表5。

表5 不同神经功能损伤程度ICVD患者HO-1水平及TLR4 mRNA相对表达量的比较 ±s

表5 不同神经功能损伤程度ICVD患者HO-1水平及TLR4 mRNA相对表达量的比较 ±s

注：与轻度损伤组比较，*P＜0.05；与中度损伤组比较，#P＜0.05；空白表示无此项。

组别 例数 HO-1/（ng/mL） TLR4 mRNA轻度损伤组 88 3.02±1.90 0.80±0.39中度损伤组 153 4.48±2.30* 1.18±0.58*重度损伤组 83 5.88±2.32*# 1.56±0.30*#F值 31.098 39.024 P值 0.000 0.000

2.5 ICVD组HO-1及TLR4 mRNA与狭窄程度、NIHSS评分的相关性

ICVD组HO-1水平及TLR4 mRNA相对表达量与颅动脉狭窄程度、NIHSS评分均呈正相关（P＜0.05）。见表6。

表6 ICVD组HO-1及TLR4 mRNA与颅动脉狭窄程度和NIHSS评分的相关性

2.6 不同预后ICVD患者HO-1水平及TLR4 mRNA相对表达量的比较

预后较好组HO-1水平及TLR4 mRNA相对表达量均低于预后不良组（P＜0.05）。见表7。

表7 不同预后ICVD患者HO-1水平及TLR4 mRNA相对表达量的比较 ±s

表7 不同预后ICVD患者HO-1水平及TLR4 mRNA相对表达量的比较 ±s

注：空白表示无此项。

组别 例数 HO-1/（ng/mL） TLR4 mRNA预后较好组 229 3.44±1.30 0.84±0.43预后不良组 95 6.30±2.21 1.76±0.64 t值 11.726 10.909 P值 0.000 0.000

2.7 HO-1及TLR4 mRNA判断ICVD预后的价值

ROC曲线分析结果显示，HO-1及TLR4 mRNA判断ICVD预后不良的最佳临界值分别为4.364 ng/mL、0.989，曲线下面积（95%可信区间）分别为0.800（0.751～0.852）、0.815（0.754～0.860），敏感性分别为81.4%、85.1%，特异性分别为72.4%、73.5%。见图1。

图1 HO-1及TLR4 mRNA判断ICVD预后不良的ROC曲线

3 讨论

ICVD主要由脑动脉血栓形成导致，但其发病机制目前尚不清楚。氧化应激反应可能在ICVD的发生、发展中起关键作用，氧化应激反应相关基因与ICVD发病风险密切相关[11]。HO-1作为细胞内的关键抗氧化酶，可通过降解血红素来产生胆绿素、一氧化碳及铁离子等，胆绿素在胆绿素还原酶的作用下进一步生成胆红素。有研究结果显示，HO-1、胆红素及一氧化碳组成的内源性保护系统在氧化应激损伤及抗炎反应中起重要作用[12]。胆红素及胆绿素可抑制脂质过氧化，清除体内的活性氧。一氧化碳可抑制内皮细胞凋亡，促进损伤区周围的内皮细胞修复和增殖，从而降低氧化应激损伤。动物实验结果显示，通过上调HO-1表达可抑制大鼠动脉粥样硬化，而抑制HO-1表达则可加重动脉粥样硬化[13]。还有研究结果显示，HO-1对炎症相关的脑损伤具有保护作用[14]。本研究结果显示，ICVD患者血清HO-1水平显著升高，与文献报道[14]基本一致。原因可能是患者发生ICVD时，脑组织急性缺血缺氧，引发炎性介质的大量释放，从而诱导HO-1表达的增加。

TLR是一类Ⅰ类跨膜受体，广泛分布于内皮细胞、上皮细胞、树突细胞及巨噬细胞等细胞中，并被认为是哺乳动物中唯一一类可将细胞外抗原识别信息传递至细胞内，进而诱导炎性反应的跨膜蛋白[15]。TLR4是TLR分子家族中的一员，可与多种外源性或内源性配体结合，进而发挥生物学效应[16]。炎症是动脉粥样硬化的主要基础之一。TLR可通过促进炎症因子，如白细胞介素6、肿瘤坏死因子α等的表达来调控血管内皮炎性损伤[17-18]。本研究结果显示，ICVD组HO-1水平及TLR4 mRNA相对表达量显著高于正常对照组（P=0.000），且颅动脉狭窄或神经功能损伤越严重，HO-1水平及TLR4 mRNA相对表达量越高，这提示TLR4及HO-1可能参与了ICVD的发生、发展。但本研究未对TLR4 mRNA及HO-1的变化机制进行研究，TLR4及HO-1参与ICVD的上游、下游关键分子及具体机制仍有待深入研究。

本研究还探讨了HO-1及TLR4 mRNA在ICVD患者预后评估中的价值。结果显示，预后较好组HO-1水平及TLR4 mRNA相对表达量均低于预后不良组（P＜0.05）。这表明TLR4及HO-1可作为评估患者预后的辅助指标。但本研究的随访时间仅为6个月，因此相关结论仍需样本量更大、随访时间更长的研究结果加以验证。

综上所述，ICVD患者HO-1水平及TLR4 mRNA相对表达量显著升高，且与病情严重程度及预后相关，因此HO-1及TLR4或可作为ICVD患者病情评估及预后判断的有效指标。