王永军，周梅花，钱小飞，陈建良，王达飞

喉癌是头颈部常见的恶性肿瘤之一[1]。据报道，2018年全球喉癌新发病例177 422例，死亡94 771例[2]。早期喉癌患者经手术、放疗和(或)化疗后生存情况较好，但晚期患者预后仍较差[3-5]。因此，了解喉癌发生、进展的驱动因素，对研究新的有效治疗方法至关重要。环状RNA(circRNA)具有吸附微小RNA(miRNA)、调控转录和剪接、翻译蛋白、调节RNA-结合蛋白等生物学功能[6]。circRNA表达失调参与喉癌细胞增殖、转移等恶性过程，在喉癌发生过程中发挥重要作用[7-8]。有研究报道，宫颈癌中circ_0084927表达水平上调，沉默circ_0084927可抑制宫颈癌细胞增殖和黏附，促进细胞凋亡，导致细胞周期阻滞[9]。然而，circ_0084927在喉癌中的表达及生物学功能尚不清楚。生物信息学分析显示，miR-623是circ_0084927的潜在靶点。研究证实miR-623在胰腺癌、乳腺癌等多种实体恶性肿瘤中异常低表达，其过表达可抑制癌细胞体内外迁移及体外转移过程[10-11]。敲减circ_0000144通过上调miR-623表达可抑制胃癌细胞增殖、侵袭、谷氨酰胺代谢，加速细胞凋亡[12]。本研究探讨circ_0084927靶向miR-623在喉癌进展中的作用，旨在揭示喉癌进展的可能机制，并为治疗提供可用靶点。

1 材料与方法

1.1组织来源 收集2017年6月—2019年6月在我院接受手术治疗的喉癌41例，取癌组织及对应癌旁组织(正常黏膜组织)，男38例，女3例，年龄51～72岁，中位年龄63岁；术前均未接受放化疗或其他生物疗法。所有患者或其家属签署知情同意书，本研究获得我院医学伦理委员会批准。

1.2细胞和试剂 人喉癌细胞TU177(上海弘顺生物科技有限公司)；重组荧光素酶报告质粒、si-NC、si-circ_0084927、miR-NC、miR-623、pcDNA、pcDNA-circ_0084927、anti-miR-NC、anti-miR-623购自广州锐博生物公司；Omniscript逆转录试剂盒、SYBR Green PCR试剂盒、miScript逆转录试剂盒(德国Qiagen公司)；细胞计数试剂盒(CCK-8)、Trizol试剂、BCA蛋白分析试剂盒(武汉博士德生物公司)；膜联蛋白V(annexin V)-异硫氰酸荧光素(FITC)凋亡检测试剂盒(上海锐赛生物公司)；剪切型半胱氨酸蛋白酶3(Cleaved-caspase3)兔多克隆抗体(ab2302)、甘油酸-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)兔多克隆抗体(ab9485)、羊抗兔IgG二抗(ab205718)、Cleaved-caspase3兔多克隆抗体(ab2324)购自上海艾博抗贸易公司。

1.3方法

1.3.1RT-qPCR检测circ_0084927和miR-623表达：用Trizol试剂从喉癌组织中提取总RNA，为检测circ_0084927表达，使用Omniscript逆转录试剂盒将1 μg总RNA逆转录成cDNA；为检测miR-623表达，使用miScript逆转录试剂盒将1 μg总RNA逆转录成cDNA。利用SYBR Green PCR试剂盒对cDNA进行RT-qPCR。U6、GAPDH分别为miR-623、circ_0084927的内参，2-ΔΔCt法计算circ_0084927和miR-623相对表达水平。circ_0084927上游引物5′-CTGGTGCAGCAAGATGGAAC-3′，下游引物5′-CTGCACCTCCCTTGGCAATA-3′；GAPDH上游引物5′-GAAGAGAGAGACCCTCACGCTG-3′，下游引物5′-ACTGTGAGGAGGGGAGATTCAGT-3′；miR-623上游引物5′-GCCGAGTGGGTTGTCGGGGACG-3′，下游引物5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′；U6上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3′，下游引物5′-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3′。

1.3.2细胞培养和实验分组：TU177细胞接种于含有10%胎牛血清、1%青链霉素的RPMI-1640培养基，在37 ℃、湿度饱和、含5% CO2的培养箱孵育。1∶2～1∶3传代。每周换液2～3次。将对数期TU177细胞接种于24孔板，密度为2×104个/孔，细胞50%融合时将si-NC、si-circ_0084927、miR-NC、miR-623 mimics、pcDNA、pcDNA-circ_0084927、si-circ_0084927+anti-miR-NC、si-circ_0084927+anti-miR-623分别转染TU177细胞，分为si-NC组、si-circ_0084927组、miR-NC组、miR-623组、pcDNA组、pcDNA-circ_0084927组、si-circ_0084927+anti-miR-NC组、si-circ_0084927+anti-miR-623组。转染48 h后，收集细胞应用RT-qPCR检测circ_0084927和(或)miR-623表达水平，随后进行以下实验。

1.3.3CCK-8法检测细胞活力：将各组TU177细胞接种于96孔板，密度为5×103个/孔，细胞贴壁后每孔加入10 μl CCK-8溶液培养箱孵育2 h，用酶标仪在450 nm处测定光密度(OD)值以表示细胞活力。实验重复3次。

1.3.4流式细胞术检测细胞凋亡情况:用含有5 μl Annexin V-FITC和5 μl碘化丙啶的100 μl 1×结合缓冲液重悬各组TU177细胞，细胞密度为1×106/ml。避光孵育15 min后，加入400 μl 1×结合缓冲液，混匀，流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况。取3次实验数据进行分析。

1.3.5平板克隆实验检测细胞克隆形成能力:将各组TU177细胞接种于6孔板，密度为2×103个/孔，置于培养箱孵育2周直到出现细胞克隆，期间每3天换液1次，4%多聚甲醛固定细胞克隆15 min，0.1%结晶紫染色20 min，在显微镜下计数>50个细胞的克隆数，收集3次重复数据。

1.3.6Western blot检测Cleaved-caspase3和Cleaved-caspase9蛋白表达:用BCA蛋白分析试剂盒对提取的蛋白进行定量，随后行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。利用半干转膜仪将蛋白转移至聚偏二氟乙烯膜，用5%脱脂奶粉室温封闭膜1 h，随后分别用一抗室温孵育膜1 h，包括Cleaved-caspase3抗体、Cleaved-caspase9抗体、GAPDH抗体；然后用酶标二抗室温孵育膜2 h。应用增强化学发光试剂盒对蛋白条带进行显色。实验重复3次。以Image J软件测得的目的蛋白和内参GAPDH灰度值的比值表示蛋白表达水平。

1.3.7双荧光素酶报告实验：根据Circular RNA Interactome预测结果扩增circ_0084927野生型(WT)和突变型(MUT)序列，并将其插入PGL4载体中，构建重组质粒WT-circ_0084927、MUT-circ_0084927。将miR-623 mimics、miR-NC分别与WT-circ_0084927或MUT-circ_0084927共转染TU177细胞，孵育48 h后用双荧光素酶检测系统检测荧光素酶活性。实验重复3次。将萤火虫荧光素酶活性归一化为海肾荧光素酶活性表示相对荧光素酶活性。

2 结果

2.1circ_0084927和miR-623在喉癌组织中的表达 与癌旁组织比较，喉癌组织中circ_0084927相对表达水平升高，miR-623相对表达水平降低(P<0.05)。见表1。

表1 喉癌组织和癌旁组织circ_0084927和miR-623的表达水平比较

2.2干扰circ_0084927表达对喉癌TU177细胞增殖、凋亡及凋亡相关蛋白表达的影响 与si-NC组比较，si-circ_0084927组TU177细胞circ_0084927相对表达水平、OD值、克隆形成数降低,凋亡率、Cleaved-caspase3和Cleaved-caspase9蛋白表达水平升高(P<0.01)。见图1和表2。

图1 干扰circ_0084927表达对喉癌TU177细胞凋亡相关蛋白表达的影响

表2 干扰circ_0084927表达对喉癌TU177细胞增殖、凋亡及凋亡相关蛋白表达的影响

2.3miR-623过表达对喉癌TU177细胞增殖、凋亡及凋亡相关蛋白表达的影响 与miR-NC组比较，miR-623组TU177细胞miR-623相对表达水平、凋亡率、Cleaved-caspase3和Cleaved-caspase9蛋白表达水平升高，OD值及细胞克隆形成数降低(P<0.01)。见图2和表3。

图2 miR-623过表达对喉癌TU177细胞凋亡相关蛋白表达的影响

表3 miR-623过表达对喉癌TU177细胞增殖、凋亡及凋亡相关蛋白表达的影响

2.4circ_0084927靶向调控miR-623的表达 Circular RNA Interactome预测到circ_0084927与miR-623序列间存在互补结合位点，见图3。miR-NC和WT-circ_0084927共转染后TU177细胞相对荧光素酶活性为1.01±0.06，miR-623 mimics和WT-circ_0084927共转染后为0.48±0.05；与miR-NC和WT-circ_0084927共转染比较，miR-623 mimics和WT-circ_0084927共转染后TU177细胞相对荧光素酶活性降低(P<0.01)。miR-NC和MUT-circ_0084927共转染后TU177细胞荧光素酶活性为1.02±0.08，miR-623 mimics和MUT-circ_0084927共转染后为0.99±0.06；miR-623 mimics和MUT-circ_0084927共转染后TU177细胞相对荧光素酶活性与miR-NC和MUT-circ_0084927共转染比较差异无统计学意义(P>0.05)。pcDNA、pcDNA-circ_0084927、si-NC、si-circ_0084927组TU177细胞miR-623表达水平为1.00±0.00、0.35±0.04、0.98±0.06、3.07±0.24；pcDNA-circ_0084927组TU177细胞miR-623表达水平低于pcDNA组，si-circ_0084927组TU177细胞miR-623表达水平高于si-NC组(P<0.05)。

图3 circ_0084927与miR-623序列中互补的结合位点

2.5抑制miR-623表达逆转了干扰circ_0084927表达对喉癌TU177细胞增殖和凋亡的作用 与si-circ_0084927+anti-miR-NC组比较，si-circ_0084927+anti-miR-623组TU177细胞miR-623相对表达水平、凋亡率、Cleaved-caspase3和Cleaved-caspase9蛋白表达降低，细胞OD值、克隆形成数升高(P<0.01)。见图4和表4。

3 讨论

circRNA在喉癌进展中作用已被证实。有研究发现，circ_0067934高表达与喉癌患者临床病理特征显著相关，circ_0067934高表达提示预后较差[13]。circRNA Ras相关序列家族2通过与miR-302b-3p相互作用并上调胰岛素样生长因子-1受体表达来促进喉癌的进展[14]。沉默circ_0042823对喉癌细胞增殖、转移及体内肿瘤生长均有抑制作用[15]。

图4 抑制miR-623表达逆转了干扰circ_0084927表达对喉癌TU177细胞凋亡的作用

表4 抑制miR-623表达逆转了干扰circ_0084927表达对喉癌TU177细胞增殖和凋亡的作用

circ_0084927是一种高表达的circRNA，研究证实敲低circ_0084927基因可明显抑制宫颈癌细胞的增殖、迁移和侵袭，并诱导细胞周期阻滞[16]；敲除circ_0084927通过上调miR-142-3p表达还可促进乳腺癌细胞凋亡，抑制细胞增殖和侵袭[17]。本研究结果显示，circ_0084927在喉癌组织中表达水平显著上调，推测circ_0084927上调可能促进了喉癌的进展。功能分析显示，转染si-circ_0084927干扰circ_0084927表达可降低TU177细胞OD值和克隆能力，促进细胞凋亡；干扰circ_0084927表达后促凋亡因子Cleaved-caspase3和Cleaved-caspase9表达水平亦显著升高。提示干扰circ_0084927表达可能通过激活caspase途径诱导细胞凋亡。上述研究结果表明，circ_0084927在喉癌中具有癌基因样作用，干扰circ_0084927表达通过调控细胞增殖和凋亡能够抑制喉癌进展。

circ_0084927在肿瘤进展中的作用均与调控miRNA有关。研究指出，circ_0084927通过靶向下调miR-142-3p、miR-634诱导靶mRNA表达上调促进宫颈癌恶性进展[18]。本研究结果证实，过表达circ_0084927可抑制miR-623表达，而干扰circ_0084927表达则促进miR-623表达，且circ_0084927与miR-623存在直接相互作用，提示circ_0084927可靶向负性调控miR-623表达。有研究报道，miR-623靶向X线交叉互补修复基因5可降低肝癌细胞增殖、侵袭能力，并促进细胞凋亡[19]。miR-623靶向细胞周期蛋白D1基因可抑制胃癌细胞增殖并增强其对5-氟尿嘧啶的化学敏感性[20]。此外，miR-623还可介导敲低长链非编码RNA羧基末端结合蛋白1反义RNA2对肝癌进展的抑制作用[21]。本研究发现，喉癌组织中miR-623表达降低，过表达miR-623可诱导TU177细胞凋亡，抑制细胞增殖，促进Cleaved-caspase3和Cleaved-caspase9蛋白表达，与干扰circ_0084927在喉癌中的抗肿瘤作用类似。为证实干扰circ_0084927表达的抗肿瘤作用依赖于miR-623表达水平升高，本研究将si-circ_0084927、anti-miR-623共转染TU177细胞，结果显示抑制miR-623表达可显著减弱干扰circ_0084927对TU177细胞增殖和凋亡的影响，表明circ_0084927至少通过靶向下调miR-623参与喉癌进展。

综上所述，circ_0084927在喉癌中表达上调，干扰circ_0084927通过靶向上调miR-623表达可抑制喉癌细胞增殖，诱导细胞凋亡。circ_0084927的作用机制与靶向负性调控miR-623表达有关。因此，靶向抑制circ_0084927/miR-623途径可能是一种有效的喉癌治疗策略。