周晓莹 黄国辉 谢 莹

（广西医科大学生命科学研究院 广西·南宁 530021）

《生物医学实验技术》是基于广西医科大学医学科学实验中心构建的基因组学研究平台、蛋白质组学研究平台和细胞与免疫研究平台等大型仪器设备为基础，针对医学门类下一年级学术型研究生开设的一门专业学位课，综合了目前医学分子生物学研究相关的基础实验技术。本课程主要教授医学实验中涉及的最具代表性的实验技术及应用，了解实验研究中的策略及技术应用，涵盖了基因组学、蛋白质组学及细胞与免疫研究平台的基础技术，包括细胞培养、免疫组织化学染色、多聚合酶链反应（PCR）、免疫印迹法（Western-blot）等等。课程宗旨是帮助科研入门的学术型研究生建立对常用实验方法的基本原理、实验仪器、实验材料及操作流程的认识。通过本课程的学习能使研究生对目前常用的生物医学实验技术有一定的了解，对其基本原理及应用领域有了加深认识，为开展研究课题奠定基础。

为了在有限的课时中实实在在地让学生了解和掌握现代分子生物学基本理论和有关实验的基本方法和技术原理，以提高学生的动手能力和创造性思维能力，本课程更注重研究生的实验操作能力的培养，将3/5的课时安排（18学时）为实验课。然而，经调查发现，学生对于课堂的知识仅仅止于实验技术原理和实验操作的掌握，但实际开展课题研究的时候则仍然会迷惘，不能很好的应用课堂所学知识。单纯的传授每一个知识点，犹如每一片分散的拼图。结合科研案例进行教学，可以有效指导学生如何拼接各知识点。

1 《生物医学实验技术》案例教学实例

本课程以教师发表的科研论文为案例载体，从课题设计思路到实验方案设计，再到实验技术原理讲解，再到数据分析方法，系统性的帮助学生形成较完整的科研思维，真正理解和掌握在医学领域中探索什么科学问题，需要使用什么实验技术，且熟悉如何开展实验。我们以广西高发的特色肿瘤-鼻咽癌的科研论文 Inactivation of 3-hydroxybutyrate dehydrogenase type 2 promotes proliferation and metastasis of nasopharyngeal carcinoma by iron retention,Br J Cancer.2020 Jan;122(1):102-110为教学案例进行阐述。

已知3-羟基丁酸脱氢酶2型（BDH2）是一种催化哺乳动物铁载体生成和调节细胞内铁代谢的酶。基于前期的生物信息学分析发现 BDH2基因在鼻咽癌组织中转录失活，因此本案例论文主要目的探究BDH2在鼻咽癌中这个基因的异常表达及其可能的生物学功能。

1.1 体外细胞培养

研究的样本除了来源于鼻咽癌组织和正常对照组织样本，还可以是体外培养的鼻咽癌细胞系和正常鼻咽上皮细胞系。由此引入体外细胞培养的概念，即通过在体外模拟体内环境，使细胞得以生存、生长、繁殖，并能维持其主要结构和功能的一种技术。

教授内容：（1）掌握细胞培养实验室的设备使用方法和保养。（2）掌握细胞培养的基本知识：培养细胞的特性，培养细胞生长的条件。（3）掌握实验器材的清洗和消毒灭菌方法。（4）掌握细胞培养常用试剂的要求和配制方法。（5）熟悉细胞培养常用合成培养液的特性。

讨论交流：如何判断细胞是否发生了污染？传授学生相关经验，一旦发生细胞污染，应当如何处置，避免继续大面积的污染。

应用拓展：（1）原代细胞培养。（2）细胞功能实验：细胞增殖实验、克隆形成实验、细胞迁移和侵袭实验等。

1.2 实时荧光定量PCR

为证实 BDH2基因在鼻咽癌细胞系和组织中的异常转录表达，需要使用PCR技术。PCR主要将五大要素混合，即：特异性引物、酶、dNTP、DNA模板和缓冲液（其中需要Mg2+），通过三个经典的步骤：变性—退火—延伸，得以实现短时间内在体外快速扩增基因片段的目的。由于本研究研究对象是 RNA，因此需要使用反转录 PCR（RTPCR），即将RNA逆转录成cDNA，再以此为模板进行PCR扩增。实时荧光定量PCR，是在PCR反应体系中加入特异性的荧光染料或探针，荧光信号的变化真实地反映了体系中模板的增加，通过检测荧光信号达到定量的目的。

教授内容：（1）掌握基因组DNA提取及纯化的原理和方法，学会使用高速离心机和紫外分光光度计。（2）通过应用PCR方法扩增目的基因，掌握PCR反应的基本原理与技术。（3）掌握琼脂糖凝胶电泳技术。（4）掌握使用实时荧光定量 PCR方法检测基因 mRNA表达的原理和方法，学会使用实时荧光定量PCR仪。

讨论交流：实时荧光定量PCR的实验方法有绝对定量法、相对定量法以及DDCT法，该如何进行选择？通过深入讨论并凝练出三种方法的异同点，阐明其检测原理，进一步举例说明什么情况下可以使用何种方法。

应用拓展：（1）染色质免疫共沉淀-PCR。（2）数字PCR技术。

1.3 免疫组织化学染色法

为进一步证实鼻咽癌中 BDH2分子在蛋白水平的表达改变，引入免疫组织化学染色技术。这是一种通过在抗体上结合可呈色的化学物质，利用免疫学原理中抗原和抗体间专一性的结合反应，检测细胞或组织中是否有目标抗原的存在。该方法不仅可以用来检测 BDH2的蛋白表达量，也可以观察BDH2所表达的定位。

教授内容：（1）掌握免疫组化及免疫荧光标记的原理和方法。（2）掌握免疫组化石蜡标本的制备、石蜡切片的捞取及脱蜡、抗体标记及显色的方法。（3）学会病理图像分析仪，以及染色结果的评分方法。

讨论交流：导致免疫组化假阳性或者假阴性发生的相关因素和预防措施。强调实验过程中阳性对照和阴性对照的必要性，对免疫组织化学染色结果的判断应持科学的、慎重的态度。

应用拓展：（1）免疫荧光染色法；双重免疫荧光染色法。（2）细胞爬片-免疫染色法。

1.4 Western-blot技术

实验已经验证 BDH2从转录和蛋白水平均在鼻咽癌组织中异常低表达，为了探究其对鼻咽癌细胞恶性生物学行为的影响，研究人员构建了BDH2的真核表达载体，通过外源性转染的方法转入鼻咽癌细胞中。为了验证转染是否成功，采用Western-blot方法验证转染后鼻咽癌细胞中 BDH2蛋白的表达水平。该技术通过把电泳分离后的细胞或组织中蛋白质从凝胶转移到固相支持物 NC膜或PVDF膜上，然后用特异性抗体检测某特定抗原的一种蛋白质检测技术，其可以通过蛋白分子量大小来判断其是否为特异性蛋白。

教授内容：（1）掌握Western-Blot检测的原理及应用。（2）掌握细胞、组织等总蛋白质提取及蛋白浓度的测定。（3）掌握Western-Blot检测的实验流程及关键条件的优化。（4）学会SDS聚丙烯酰胺凝胶的制备、蛋白质的转印和化学发光ECL试剂盒的使用。

讨论交流：Western-blot和免疫组织化学染色法都可以检测蛋白的表达量，两者分别有什么优势和劣势？通过对比加深印象，有助于学生对科研过程中对实验手段选择的判断。

应用拓展：（1）免疫共沉淀。（2）单细胞Western-blot技术。

1.5 流式细胞术

流式细胞术是一种用于对悬浮于流体中的细胞进行计数和分选。这种技术可以用来对流过光学或电子检测器的一个个细胞进行连续的多种参数分析，包括定量测定细胞DNA含量、细胞体积、蛋白质含量、细胞表面抗原等。对于肿瘤生物学方面的研究来说，流式细胞术最常用于检测肿瘤细胞的凋亡和细胞周期。

教授内容：（1）掌握流式细胞仪的工作原理。（2）熟悉细胞凋亡和细胞周期检测的原理。（3）学会制备细胞凋亡和细胞周期检测的细胞样本。（4）熟悉流式细胞仪的使用方法。

讨论交流：如何选择合适的荧光素？包括抗原密度、自发荧光、非特异性结合等等多方面考虑，从而培养学生从多个角度思考问题。

应用拓展：（1）分选流式细胞术。（2）质谱流式细胞术。

2 案例教学反思

案例教学是一种开放式、互动式的教学方法，教学过程重参与、重感悟，是一种沉浸式的学习课堂，充满了理性的思维。本课程事先安排学生通读案例论文，为学生搭建一个模拟的科研场景，让学生把自己纳入研究过程中，仿佛作为研究人员全程参与了其中的主要实验。通过讨论、交流等互动方式，加强师生之间的交流，进一步达到启示理论和启迪思维的目的，提高学生分析和解决问题的能力，更有获得感[1]。

2.1 教学目标

在《生物医学实验技术》课程中，我们的教学目标不仅包括知识目标，还有能力目标和情感目标。知识目标是学生可以掌握医学科学研究领域中常用的实验技术，掌握其原理及其应用领域，熟练掌握实验的操作。能力目标包含学生获取新知识的能力、批判性思维的能力、分析和解决问题的能力、交流和合作的能力、创新思维的能力。情感目标主要有：（1）通过讨论交流、联合开展实验等，体验合作研究的快乐。（2）认同肿瘤给家庭和社会带来的影响，增强对患者的同情关爱之心和对社会的责任使命感。

2.2 教师角度

教师作为案例教学的主导者，其不再是单个知识点的教授方式，而是需要承上启下，将课程内容恰当地串在一个研究型案例中。教师围绕整体教学内容，有针对性地选择好案例。本课程选择了任课老师参与发表的SCI论文，内容为广西常见高发肿瘤-鼻咽癌的发病机制研究。一方面鼻咽癌为广西医科大学特色科研方向之一，增强学生对区域特色高发肿瘤的关注度和认识度；一方面真正实现科研反哺教学，将科研运用于教学有助于培养学生的创新意识和创新能力[2]。任课老师熟悉论文研究的过程，可以更好的作为案例讨论过程的“引导者”，不断推动学生的思维探究活动向纵深发展，以达成多维度的教学目标。

2.3 学生角度

在案例教学中，学生是教学的主体，他们主动阅读文献、查阅资料、做实验步骤设计、操作实验并分析结果，整合加工有效的知识点。在讨论交流过程中，倾听他人观点，并且陈述个人的见解，互相取长补短，从而对知识的理解也更系统和全面。学生在自主学习和体验的过程中还收获了不论是成功或是失败的经验，体验到科学探究的艰辛与乐趣，体验到科研人员的辛勤付出，体验到医学科学进步给人类健康带来的巨大推动作用，激发起学术型研究生为医学科研事业奉献的热情。