高红侠，白青云*，赵立，卢河东，王雨

淮阴工学院生命科学与食品工程学院（淮安 223003）

大蒜（Allium sativumL）又名胡蒜，属百合科葱属植物。大蒜鳞茎除含有碳水化合物、蛋白质等基本营养素外，还富含维生素、含硫化合物，以及锗和硒等多种微量元素[1]。药理学研究表明，大蒜提取物具有广谱抗菌作用，能阻断人体内亚硝胺合成等作用，对直肠癌、食道癌等有预防作用，同时还能提高免疫力、抗血栓、保护肝脏等功能[2]。

大蒜食用时存在去皮困难、费时等问题，因此大蒜去皮后的蒜米受到消费者青睐。蒜米是具有新陈代谢能力的活体，对蒜米进行发芽处理能富集γ-氨基丁酸（GABA）。GABA是生物体内广泛存在的一种非蛋白质氨基酸，由谷氨酸经谷氨酸脱羧酶（GAD）转化而来[3]。GABA是哺乳动物脑和脊髓中的抑制性神经递质，具有降血压、抗癌、抗肿瘤、改善脑功能等功效[4]。最新研究表明，体内GABA水平与帕金森患者的记忆力呈正相关[5]。我国已批准GABA为新食品原料[6]，动植物性食物原料中GABA质量分数很低，很难从天然食物中大量摄取。因此，食物中富集GABA成为功能食品研究热点之一。

试验选用种植面积广、功能丰富的蒜米作为原料，采用发芽法，研究蒜米富集GABA的关键技术，为开发功能性大蒜产品提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

大蒜，市售；GABA标准品，购自美国Sigma化学品公司；谷氨酸钠（MSG）、维生素B6（VB6）、氯化钙（CaCl2）、乙醇、乙酸、四硼酸钠、苯酚、次氯酸钠等，均购于国药集团化学试剂有限公司，分析纯。

722N可见分光光度计（上海菁华科技仪器有限公司）；TDL-40B型离心机（上海安亭仪器厂）；PHSJ-3F台式酸度计（上海雷磁酸度计）；HHS-2S恒温水浴锅（上海虞龙仪器设备有限公司）；SPX-250B-Z型生化培养箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；BCD-185HFA型冰箱（澳柯玛股份有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 材料处理方法

挑选一定量完好的新鲜大蒜，剥去外皮，即为蒜米，用1%次氯酸钠溶液消毒30 min，取出用清水冲洗后吸去明水，摆放在垫有纱布的白瓷盘中，用去离子水或不同pH的缓冲液（柠檬酸-磷酸氢二钠）浸渍淹没蒜米，置于黑暗环境在一定温度下培养一定时间。届时将蒜米取出用吸水纸吸干表面液体，测定其GABA质量分数（鲜重）。

1.2.2 蒜米富集GABA的培养工艺试验

首先对蒜米富集GABA的培养工艺进行单因素试验，设定培养温度20～35 ℃、培养时间0～60 h、缓冲液pH 4.6～6.2，测定蒜米中GABA质量分数。在单因素试验的基础上，根据正交试验设计原理，对培养工艺的三因素进行优化，选出蒜米富集GABA的最佳培养工艺。

1.2.3 蒜米富集GABA的培养液中外源添加物试验

为进一步提高蒜米中GABA质量分数，在最佳培养工艺的基础上，在培养液中添加促进GAD活性的物质或GABA合成的底物。谷氨酸钠（MSG）质量浓度设为 6～18 mg/mL；维生素B6（VB6）质量浓度设为0.01～0.04 mg/mL；CaCl2浓度设为1.0～4.0 mmol/L。所有溶液都由10 mmol/L的柠檬酸缓冲液配制而成，调节初始pH至5.8。根据Box-Behnken试验设计原理，对外源添加物组分进行优化，确定最佳的培养液中外源添加物浓度。

1.3 GABA测定方法

将蒜米样品进行充分磨碎，精确称取1 g，参照白青云等[7]的方法，采用比色法测定样品中GABA质量分数。

1.4 数据统计与分析

试验进行3次重复，避免出现偶然因素影响试验结果。采用Design Expert 8.0设计软件处理试验数据，并对数据进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 培养工艺对蒜米中GABA质量分数的影响

2.1.1 培养温度对蒜米GABA质量分数的影响

由图1可见：蒜米在温度20～35 ℃范围内用去离子水培养36 h，培养温度对蒜米中GABA质量分数有显著影响，呈先上升后下降的趋势。25 ℃时蒜米中GABA质量分数最高，为0.320 mg/g，分别比20 ℃时和35 ℃时提高43.50%和51.66%，说明在一定温度范围内，适宜的培养温度促进蒜米中GABA质量分数增加，最适温度为25 ℃。其原因是在一定温度范围内，适宜的培养温度可以增强GAD的活性，进而促进蒜米中GABA质量分数增加。调节发芽温度可以使糙米有效地富集GABA[8]，此次研究结果与其一致。

图1 培养温度对蒜米富集GABA的影响

2.1.2 培养时间对蒜米发芽富集GABA质量分数的影响

从图2可以看出：蒜米在25 ℃去离子水培养0～60 h范围内，蒜米中GABA质量分数呈先缓慢增加后急速降低的趋势。培养48 h时GABA质量分数最高，为0.347 mg/g，是原料（0.143 mg/g）的2.43倍。因此，48 h是蒜米富集GABA的适宜时间。培养时间过短，GAD没有得到充分的激活；培养时间过长，GABA则会因谷氨酸转氨酶催化形成琥珀酸半醛[9]。

图2 培养时间对蒜米富集GABA影响

2.1.3 培养液pH对蒜米中GABA质量分数的影响

蒜米在温度20 ℃培养36 h，培养液pH对蒜米中GABA质量分数的影响见图3。pH在4.6～5.8之间，GABA质量分数随pH的升高而缓慢升高；pH在5.8～6.2之间时则相反。蒜米中GABA质量分数在pH 5.8时最高，为0.373 mg/g，比原料提高了160.84%。由此可知，培养液pH 5.8对蒜米富集GABA的效果最佳。蒋振晖等[10]研究发现，低酸性环境有利于激活GAD。此次研究也得出相似结论。

图3 不同pH对蒜米富集GABA的影响

2.1.4 正交试验法优化蒜米富集GABA的培养工艺

正交试验优化的蒜米富集GABA的试验设计和结果见表1。结果表明，蒜米富集GABA的最佳培养工艺为A1B1C2，即培养温度为20 ℃、培养时间为36 h、培养液pH为5.8。由极差分析可知，培养液pH是最主要的影响因素，培养温度次之，最后是培养时间。在最佳培养工艺下，蒜米中GABA质量分数为0.439 mg/g，是原料的3.07倍。

表1 蒜米富集GABA的培养工艺正交试验结果

2.2 培养液中外源添加物对蒜米富集GABA的影响

2.2.1 MSG浓度对蒜米GABA质量分数的影响

由图4可知：MSG在6～18 mg/mL浓度范围内，蒜米中GABA质量分数随着培养液中MSG浓度的增加呈先上升后下降趋势。当MSG浓度为10 mg/mL时，GABA质量分数最高，为0.705 mg/g，是最优培养工艺下（0.439 mg/g）的1.61倍。MSG作为植物GAD的专一底物，可以促进GABA的合成[11]。南瓜籽培养液中添加MSG可以提高GABA的富集量[12]，此次研究结果与其一致。

图4 MSG浓度对蒜米富集GABA的影响

2.2.2 CaCl2浓度对蒜米中GABA质量分数的影响

培养液中添加CaCl2对蒜米中GABA富集的影响见图5。

图5 CaCl2浓度对蒜米富集GABA的影响

CaCl2在1～4 mmol/L浓度范围内，蒜米GABA质量分数呈现出先增加后降低的趋势。当CaCl2浓度为3 mmol/L时，GABA富集量最高，为0.696 mg/g，比最优培养工艺下提高58.54%。GAD末端有一个钙调素结合域，并且GAD活性由钙离子（Ca2+）或CaM调节[13]，因此增加胞质Ca2+浓度可以刺激GAD活性，进而促进GABA质量分数增加。

2.2.3 VB6对蒜米GABA质量分数的影响图6显示：添加VB6能有效促进蒜米富集GABA。VB6在0.02 mg/mL时，蒜米中GABA质量分数最高，为0.679 mg/g，比最优培养工艺下提高54.67%。研究表明，VB6是GAD的辅基磷酸吡哆醛（PLP）的前体物质，有激活GAD达到富集GABA的作用[14]。

图6 VB6浓度对蒜米富集GABA影响

2.2.4 蒜米富集GABA的外源添加物组分优化

Box-Behnken试验设计的优化蒜米富集GABA的培养液中外源添加物组分方案和结果见表2。

表2 蒜米富集GABA的培养液中添加物浓度试验方案和结果

运用Design Expert软件，对表4数据进行二次多元逐步回归拟合，得到蒜米富集GABA预测值的二次多项逐步回归方程：

Y=-0.431 54+0.111 513X1+0.418 95X2+7.255 00X3+1.312 50E-003X1X2+0.337 50X1X3+0.900 00X2X3-6.489 06E-003X12-0.0743 25X22-305.750 00X32

运用方差分析上述回归模型，模型的F=110.92，p＜0.000 1，因此该回归模型是非常有效的，回归模型的决定系数R2=0.993 0，说明模型具有良好的相关性，可用于指导实践。

由表3可见：MSG的一次项和二次项对蒜米GABA质量分数有极显著影响，CaCl2的二次项对蒜米中GABA质量分数有极显著影响（p＜0.01），VB6的一次项和二次项对蒜米中GABA质量分数有显著影响（p＜0.05）。MSG和VB6两者的交互作用对蒜米富集GABA的影响显著（p＜0.05）。

表3 回归模型方差分析

在试验设定的因素水平范围内，根据回归分析法所得的二次方程，得到交互作用影响显著的两变量之间二次回归方程的响应曲面图，见图7。当CaCl2浓度为3.0 mmol/L时，在固定的MSG浓度下，GABA质量分数随VB6浓度的增加呈先增加随后缓慢下降的趋势。当VB6浓度为0.029 mg/mL时，GABA富集量最大。当MSG浓度为10.17 mg/mL时，GABA质量分数最高。

图7 MSG和VB6的交互作用对蒜米GABA质量分数影响的响应曲面图

从Box-Behnken试验结果得出，当培养液中MSG浓度为10.17 mg/mL、CaCl2浓度为3.02 mmol/L、VB6浓度为0.029 mg/mL时，蒜米富集GABA最高，此即为最佳培养液中外源添加物浓度。在此条件下蒜米中GABA富集量预测值为0.827 mg/g，通过验证试验，测得的实际值为0.832 mg/g，预测值与实际值高度相符，从侧面证明所建立模型可靠，可以预测响应值和组分浓度之间的关系。在最佳培养液中外源添加物培养下，蒜米GABA的质量分数为最优培养工艺的1.90倍，是原料的5.81倍，说明培养液中添加了外源添加物后能显著提高蒜米中GABA质量分数。

3 结论

采用正交试验设计优化了蒜米富集GABA的最佳培养工艺，即培养温度20 ℃、培养时间36 h，培养液pH 5.8，三因素的影响顺序依次为培养液pH＞培养温度＞培养时间，此时蒜米中GABA的富集量为0.439 mg/g，是原料的3.07倍。响应面优化的最佳培养液外源添加物浓度为MSG浓度10.17 mg/mL、CaCl2浓度3.02 mmol/L和VB6浓度0.029 mg/mL，此时蒜米中GABA质量分数为0.832 mg/g，是原料的5.81倍。由方差分析可知，MSG的一次项和二次项，CaCl2二次项，VB6的一次项和二次项以及MSG和VB6的交互作用均显著影响蒜米中GABA质量分数。