王冉冉， 孙政勤， 刘江月

（1山东大学附属威海市立医院消化科，山东威海264200；2潍坊医学院病理生理教研室，山东潍坊261053）

随着社会的发展，人们饮食结构的改变，2 型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）的发病率正在节节攀升。糖尿病患者多伴有多器官并发症，这也是导致T2DM 患者死亡的主要原因。流行病学调查显示，糖尿病患者中合并肝脏病变者高达50%以上，其中非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）最常见［1］，若不进行干预治疗，可进一步发展成为非酒精性脂肪性肝炎、肝纤维化，甚至肝癌［2］。研究显示，糖尿病患者中终末期肝病的死亡率显著高于心血管疾病［3］。目前认为，T2DM 糖脂代谢紊乱导致的氧化应激过度及炎症因子的异常分泌，是糖尿病肝损伤的主要发生机制［4］。NF-κB是多种炎症信号通路的关键因子，NF-κB 激活后可促进多种炎症因子释放，介导炎症反应的发生［5］。过氧化物酶体增殖物激活受体γ（peroxisome proliferatoractivated receptor γ，PPARγ）是配体活化型的核转录因子，可减少 NF-κB 活化，是 NF-κB 关键的负调控因子，具有抑制炎症因子生成的重要作用［6］。梓醇（catalpol，CAT）属于环烯醚萜类化合物，是地黄的有效活性成分，具有降低血糖、抗氧化应激和抗炎［7-8］等多种药理作用。课题组前期研究发现，梓醇能够减轻糖尿病早期内皮细胞损伤［9-10］，保护糖尿病大血管［11］，但梓醇对2 型糖尿病引起的肝脏损伤是否同样具有保护作用呢？其作用是否与PPARγ/NF-κB信号通路有关？均未见报道。本研究通过观察梓醇对 T2DM 大鼠肝脏的影响，并从 PPARγ/NF-κB 信号通路的角度探讨其可能机制。

材料和方法

1 动物与饲料

清洁级 SD 大鼠，体重180～220 g，购自济南金丰实验动物有限公司，许可证号为SCXK（鲁）2014-0006。普通饲料及高脂饲料购自南通特洛菲饲料科技有限公司。

2 试剂与仪器

梓醇（纯度≥98%）购于成都植标化纯生物科技有限公司；二甲双胍（metformin，MET）购自中美上海施贵宝制药有限公司；水飞蓟素（silymarin，SIL）购自上海麦克林生化科技有限公司；血清丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）、白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）和肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA 试剂盒、抗 NF-κB 和 PPARγ 抗体及 NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction 试剂盒均购于碧云天生物技术研究所。PCR 仪、转膜仪和凝胶成像分析仪购自Bio-Rad。

3 方法

3.1 动物模型的建立与分组 70只清洁级SD 大鼠适应性饲养1周，腹腔注射小剂量链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）后，选取血糖大于11.1 mmol/L 的60只大鼠，随机分为糖尿病模型（model，MOD）组、二甲双胍（MET；100 mg·kg-1·d-1）组、水飞蓟素（SIL；100 mg·kg-1·d-1）组 、梓 醇 低 剂 量（low-dose CAT，CAT-L；10 mg·kg-1·d-1）组、梓醇中剂量（middle-dose CAT，CAT-M；50 mg·kg-1·d-1）和梓醇高剂量组（highdose CAT，CAT-H；100 mg·kg-1·d-1）组，高脂饲料喂养，另以10 只健康雄性SD 大鼠为对照（control，CON）组，普通饲料喂养，造模同时灌胃给药，造模时间8 周。于8 周末麻醉大鼠，称量体重，腹主动脉快速取血备用，随后处死大鼠，收集肝脏标本。

3.2 肝脏指数的计算 肝脏指数（%）=肝重（g）/大鼠体重（g）×100%

3.3 血清指标的检测 采用全自动生化分析仪检测空腹血糖（fasting blood glucose，FBG）、总胆固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、ALT 和 AST 水平；糖化血红蛋白（glycated hemoglobin，HbA1c）试剂盒检测糖化血红蛋白水平，操作严格按照说明书进行。

3.4 ELISA法检测血清IL-6和TNF-α的水平 分离血清，分别采用试剂盒检测IL-6 及TNF-α 的水平，严格按照试剂盒说明进行实验操作，测定450 nm 处吸光度（A）值。

3.5 HE 染色观察肝脏的病理变化 取10%福尔马林固定的肝脏组织，石蜡包埋后，4 μm连续切片，HE染色，光镜下观察肝脏损伤情况，并由2 名病理科医生同时阅片根据肝脏病理半定量评分标准进行评分［12］。正常肝脏组织为 0 分，肝细胞水肿为 1 分，肝细胞空泡样变为2 分，肝组织点状坏死并门静脉内炎症细胞浸润为3分，肝组织片状坏死为4分。

3.6 油红O 染色观察肝脏的变化 取冰冻肝脏组织，于冰冻切片机中，10 μm 连续切片，4%中性甲醛固定10 min后，蒸馏水冲洗，60%异丙醇分化30 s，油红O 染色，60%异丙醇分化后，苏木精复染，光镜下观察肝脏的变化。

3.7 RT-qPCR 检测肝脏组织中 IκB 的 mRNA 表达取部分肝脏组织研磨后，Trizol 法提取总RNA，合成cDNA，进行PCR 扩增，严格按说明书操作，以GAPDH为内参照，引物序列见表1。

3.8 Western blot 检测肝脏组织中PPARγ 的蛋白表达及NF-κB p65 蛋白核转位 取部分肝脏组织研磨后，加入RIPA 裂解液提取总蛋白，采用NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction 试剂盒分别提取胞浆和胞核蛋白，所有蛋白电泳、转膜后，5%脱脂奶粉封闭1 h 后分别加Ⅰ抗（1∶500），4 ℃过夜，TBST 漂洗3次，加入Ⅱ抗孵育1 h，化学发光反应，图像分析。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1. The sequences of the primers for RT-qPCR

4 统计学处理

采用统计学软件SPSS 18.0进行分析，计量资料以均数±标准差（mean±SD）表示，多组间采用单因素方差分析，组间采用 SNK-q进行比较，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1 梓醇对T2DM 大鼠肝脏指数、FBG、HbA1c、TC、TG、ALT和AST的影响

与 CON 组比较，MOD 组的肝脏指数、FBG、HbA1c、TC、TG、ALT 和 AST 等指标均明显升高（P＜0.05）；与MOD 组比较，CAT-L 组上述指标的差异无统计学显著显著性（P＞0.05），MET组、SIL组、CAT-M组和CAT-H 组的各指标均显著降低（P＜0.05）；其中CAT-H 组的肝脏指数、TC、TG、ALT 和 AST 较 MET 组和SIL 组降低更加明显（P＜0.05），提示梓醇能够降低T2DM 大鼠血糖和血脂，减轻肝脏损伤，高剂量组效果优于二甲双胍和水飞蓟素，见表2、3。

表2 梓醇对各组大鼠肝脏指数、FBG和HbA1c的影响Table 2. Effects of catalpol on liver weight index，FBG and HbA1c in rats of different groups（Mean±SD. n=10）

表3 梓醇对各组大鼠TC、TG、ALT和AST的影响Table 3. Effects of catalpol on TC，TG，ALT and AST in rats of different groups（Mean±SD. n=10）

2 梓醇对T2DM大鼠IL-6和TNF-α的水平的影响

与 CON 组比较，MOD 组的 IL-6 和 TNF-α 的水平均明显升高（P＜0.05）；与MOD 组比较，CAT-L 组上述指标的差异无统计学显著性（P＞0.05），MET 组、SIL组、CAT-M组和CAT-H组的IL-6和TNF-α的水平均明显降低（P＜0.05）；其中 CAT-H 组较 MET 组和SIL组各指标变化更加明显（P＜0.05），提示梓醇能够降低T2DM 大鼠炎症因子水平，改善肝脏功能，见图1、2。

3 梓醇对T2DM大鼠肝脏形态的影响

Figure 1. Effects of catalpol（CAT）on the serum levels of IL-6 in the rats of different groups. Mean±SD. n=10.*P＜0.05 vs CON group；#P＜0.05 vs MOD group；△P＜0.05 vs MET group；▲P＜0.05 vs SIL group.图1 梓醇对各组大鼠血清IL-6水平的影响

Figure 2. Effects of catalpol（CAT）on the serum levels of TNF-α in the rats of different groups. Mean±SD. n=10.*P＜0.05 vs CON group；#P＜0.05 vs MOD group；△P＜0.05 vs MET group；▲P＜0.05 vs SIL group.图2 梓醇对各组大鼠血清TNF-α水平的影响

HE 染色结果显示，CON 组的肝细胞排列规则，组织结构清晰；MOD组的肝细胞排列松散，见大量脂肪空泡，肝小叶肝索结构紊乱，炎症细胞浸润，偶见点状坏死；与MOD 组比较，CAT-L 组无明显改善，MET 组、SIL 组、CAT-M 组和 CAT-H 组的肝细胞排列规则，脂肪空泡、炎症细胞均明显减少，形态得到明显改善。肝脏病理半定量评分统计结果显示，与MOD 组比较，MET 组、SIL 组、CAT-M 组和 CAT-H 组病理学评分显著降低（P＜0.05），其中CAT-H 组的病理学评分低于MET组和SIL组（P＜0.05），见图3、4。

油红O 染色结果显示，CON 组的肝细胞形态正常，仅有很少量脂肪细胞被染成红色，无脂肪变性；MOD 组的肝细胞排列不规则，组织大面积被染成红色，明显脂肪变性，有大量脂质沉积；与MOD 组比较，CAT-L 组未见显著改变，MET 组、SIL 组、CAT-M组和CAT-H 组的肝细胞排列比较规则，脂肪变性程度明显减轻，提示梓醇能够改善T2DM 大鼠肝脏的脂肪变性，见图5。

4 梓醇对T2DM 大鼠肝脏组织中IκB mRNA 表达的影响

与 CON 组比较，MOD 组 IκB 的 mRNA 表达明显减少（P＜0.05）；与MOD 组比较，CAT-L 组未见明显增多（P＞0.05），MET 组、SIL 组、CAH-T-M 组和CATH 组 IκB 的 mRNA 表达均明显增多（P＜0.05）；其中CAT-H 组较 MET 组和 SIL 组 IκB 的 mRNA 表达增多更加显著（P＜0.05），提示梓醇促进 IκB 的 mRNA 表达且效果优于二甲双胍和水飞蓟素，见图6。

5 梓醇对T2DM 大鼠肝脏组织中PPARγ蛋白表达的影响

Figure 3. Effects of catalpol（CAT）on the morphological changes of rat liver tissues in different groups（HE staining，×400）.图3 HE染色观察梓醇对各组大鼠肝脏形态的影响

Figure 4. Effects of catalpol（CAT）on liver histopathological scores in different groups. Mean±SD. n=10.*P＜0.05 vs CON group；#P＜0.05 vs MOD group；△P＜0.05 vs MET group；▲P＜0.05 vs SIL group.图4 梓醇对各组大鼠肝脏组织病理评分的影响

与CON组比较，MOD组的PPARγ蛋白明显减少（P＜0.05）；与 MOD 组比较，CAT-L 组未见显著增多（P＞0.05），MET 组、SIL 组、CAT-M 组和 CAT-H 组的PPARγ 蛋白表达均明显增多（P＜0.05）；CAT-H 组较MET 组和SIL 组增多更加明显（P＜0.05），提示梓醇能够促进PPARγ 蛋白表达且效果优于二甲双胍和水飞蓟素，见图7。

6 梓醇对T2DM 大鼠肝脏细胞核内NF-κB 表达的影响

与 CON 组比较，MOD 组核内 NF-κB p65 蛋白的表达明显增多（P＜0.05）；与MOD 组比较，CAT-L 组未见显著减少（P＞0.05），MET 组、SIL 组、CAT-M 组和CAT-H 组核内NF-κB p65 蛋白的表达均显著减少；CAT-H 组较 MET 组和 SIL 组减少更加明显（P＜0.05），提示梓醇能够抑制NF-κB 活化且效果优于二甲双胍和水飞蓟素，见图8。

讨 论

Figure 5. Effects of catalpol（CAT）on rat liver morphological changes in different groups observed by oil red O staining（×400）.图5 油红O染色观察梓醇对各组大鼠肝脏形态的影响

Figure 6. Effects of catalpol（CAT）on the mRNA expression of IκB in the rat liver of different groups. Mean±SD. n=10.*P＜0.05 vs CON group；#P＜0.05 vs MOD group；△P＜0.05 vs MET group；▲P＜0.05 vs SIL group.图6 梓醇对各组大鼠肝脏组织中IκB mRNA表达的影响

T2DM 可引起多脏器并发症的发生，肝损伤就是其常见并发症之一，非酒精性脂肪肝是T2DM 肝损伤的早期表现，长期NAFLD 又可引发严重的葡萄糖与脂质代谢紊乱，加重糖尿病及其他并发症的发生。因此，寻找治疗糖尿病并预防肝损伤的药物尤为重要。中草药本身及其提取物因其具有多靶点、不良反应小等特点已被广泛用于治疗各种疾病，包括糖尿病及其肝损伤的治疗，并显示了较好的疗效［13］。本课题组在前期研究中发现，梓醇能够防治T2DM大鼠大血管病变［10-11］，而梓醇是否能够防治糖尿病引起的肝损伤未见报道。本研究采用高脂饮食联合小剂量STZ 注射制备2 型糖尿病大鼠模型，8 周后模型组大鼠肝脏出现明显的脂肪变性，肝功能明显受损，而梓醇干预的大鼠肝脏脂肪变性损伤明显减轻，肝功能也得到明显改善，说明梓醇能够减轻T2DM 引起的肝脏损伤。

NF-κB 通路是对氧化应激最敏感的胞内信号传导途径之一，从转录水平上调控炎症因子的表达，是调控转录多种炎性因子的共同通路。IκB（inhibitor of NF-κB）是NF-κB的抑制蛋白。在静息状态下，IκB与NF-κB 结合以失活状态存在于细胞质中，当受到氧化应激等因素刺激时，IκB 磷酸化并降解，使得NF-κB 活化，并从细胞质转移到细胞核内，与相应的炎症相关基因结合，启动炎症因子转录表达。近年来的研究证实，活化的PPARγ 可以通过抑制NF-κB等转录因子的活性来负向发挥间接转录调控的效应，明显抑制炎症反应，PPARγ/NF-κB信号途径为调控炎症的一个重要靶点［14-15］。Jiménez-Flores 等［16］发现姜黄素能减轻DM 所致肝损伤，并且肝组织PPARγ蛋白表达显著増加，而NF-κB表达降低，其机制可能与 PPARγ/NF-κB 信号通路有关。Motteleb等［17］发现通过激活PPARγ介导NF-κB信号通路从而抑制炎症和氧化反应。Belfort 等［18］发现PPARγ 能通过抑制NF-κB 信号通路的活化来抑制炎症因子IL-6和TNF-α 的分泌。课题组前期研究发现梓醇能够抑制NF-κB活化，有效减轻ox-LDL诱导EA.hy926细胞炎症因子TNF-α 的表达［9］。本研究发现糖尿病模型组肝脏的PPARγ 表达明显降低，细胞核内NF-κB p65的蛋白含量明显增多，同时也发现血清中IL-6和TNF-α的水平显著升高，说明糖尿病大鼠肝脏NF-κB信号通路活化，炎症反应明显；经梓醇干预后，PPARγ 蛋白表达显著增加，细胞核内 NF-κB 蛋白含量明显减少，血清中IL-6 和TNF-α 的水平显著下降，表明梓醇可能通过PPARγ/NF-κB 信号通路抑制了炎症反应，减轻了T2DM大鼠肝脏损伤。

Figure 7. Effects of catalpol（CAT）on the protein expression of PPARγ in the rat liver of different groups. Mean±SD. n=10.*P＜0.05 vs CON group；#P＜0.05 vs MOD group；△P＜0.05 vs MET group；▲P＜0.05 vs SIL group.图7 梓醇对各组大鼠肝脏PPARγ蛋白表达的影响

Figure 8. Effects of catalpol（CAT）on nuclear protein expression of NF-κB in the rat liver of different groups. Mean±SD. n=10.*P＜0.05 vs CON group；#P＜0.05 vs MOD group；△P＜0.05 vs MET group；▲P＜0.05 vs SIL group.图8 梓醇对各组大鼠肝脏细胞核内NF-κB表达的影响