杨亚丽 ， 田 荣 ， 袁 茵 ， 王艳佳 ， 杨晓玲 △

（1宁夏医科大学基础医学院，2国家卫生健康委员会代谢性心血管疾病研究重点实验室，3宁夏血管损伤与修复研究重点实验室，宁夏银川750004）

同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）是体内甲硫氨酸和蛋氨酸循环的代谢产物，在正常情况下一般维持在较低的水平。目前研究已证实，高同型半胱氨酸血症（hyperhomocysteinemia，HHcy）可以作为多种疾病如心脑血管疾病、肾损伤和脑卒中等的独立危险因素［1］，尤其是冠心病和脑卒中等，其致病机制与促进血管平滑肌细胞增殖、增加血小板聚集、损伤血管内皮和激活免疫反应等有关［2-3］。Ras 相关蛋白1（Ras-related protein 1，Rap1）是小分子 G 蛋白 Ras超家族成员之一，在各种因子刺激下，与细胞膜上的受体结合，对细胞的增殖、迁移和分化等进行调控，已成为疾病防治的新靶标［4］。Pei 等［5］发现，肿瘤坏死因子 α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）通过触发腺苷酸环化酶激活gp91phox，而该过程涉及Rap1A 激活，提示Rap1A 通过免疫炎症反应参与了疾病的调控。但Rap1A 在Hcy 致巨噬细胞增殖及其在免疫应答中的作用尚不清楚。本研究以ANA-1小鼠巨噬细胞为研究对象，探讨Rap1A 在Hcy 致ANA-1 细胞增殖及M1 极化中的作用，为Hcy 相关疾病的预防和治疗提供理论依据。

材料和方法

1 主要试剂

ANA-1 小鼠巨噬细胞购自中国医学科学院细胞培养中心。Hcy（Sigma）；胎牛血清购自 Gibco；蛋白提取试剂盒和蛋白定量试剂盒（江苏凯基生物技术有限公司）；总RNA 提取试剂盒（天根生化科技有限公司）；逆转录试剂盒和荧光定量PCR 试剂盒（TaKa-Ra）；抗Rap1A 单克隆抗体和抗p27 单克隆抗体（Abcam）；抗增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）单克隆抗体（Affinity）；EdU 染色试剂盒（广州市锐博生物科技有限公司）；小鼠ELISA 检测试剂盒（伊莱瑞特生物科技股份有限公司）；Rap1A干扰腺病毒（Ad-shRNA/Rap1A）由汉恒生物科技有限公司提供；引物由上海生工生物工程有限公司设计并合成。

2 实验仪器

超净工作台（江苏安泰）；CO2培养箱（Heraeus）；5415D 型微量台式离心机（Eppendorf）；BS110S 型精密天平（Sartorius）；荧光定量PCR 仪、垂直电泳仪和Model 680全自动酶标仪（Bio-Rad）。

3 实验方法

3.1 细胞培养 将ANA-1 细胞以1×106个接种于25T透气培养瓶中，用含10%胎牛血清及1%青-链霉素的 RPMI-1640 培养液，于 37 ℃、含5% CO2的培养箱中常规培养，隔日换液，根据细胞的生长状态，当细胞数约每瓶2×106个时传代。用含终浓度100 μmol/L 的 Hcy 培养液干预细胞 24 h，建立 HHcy 细胞模型，用于后续实验。

3.2 细胞分组及Rap1A 干扰腺病毒转染 将3.1培养的处于对数生长期的细胞铺于6 孔板，用100 μmol/L 的 Hcy 干预 24 h 后，记为 Hcy 组；正常对照（control）组仅加入等量的完全培养基；将10 μL 感染复数为100 的Ad-shRNA/Rap1A 及其阴性对照（AdshRNA/GFP），分别转染至ANA-1 巨噬细胞后用100 μmol/L Hcy 处理，分别记为Hcy+Ad-shRNA/Rap1A组和Hcy+Ad-shRNA/GFP组；6 h后换正常培养基，由于腺病毒载体中含有GFP基因，48 h 后荧光显微镜观察转染效率，实验重复3次。

3.3 CCK-8 检测ANA-1 细胞活力 取指数增殖期的ANA-1 细胞接种于96 孔板（每孔3×103个）。将培养板放在37 ℃、5% CO2培养箱内培养孵育过夜，待细胞密度达60%～70%时，用100 μmol/L Hcy 刺激24 h 后，分别向 96 孔板每孔加入 10 μL 的 CCK-8 溶液，继续培养2 h，用酶标仪测定在450 nm 处的吸光度（A）值，实验重复3次。

3.4 EdU 染色法检测细胞增殖 细胞处理方法同3.3，将处理后的细胞按照每孔1×104的密度接种到24 孔板，刺激24 h 后，根据EdU 染色试剂盒检测DNA 增殖活性，向细胞中加入 50 μmol/L EdU 试剂，孵育 2 h 后，PBS 洗掉未渗入 DNA 的 EdU 并加入 4%多聚甲醛固定细胞30 min，PBS 洗除固定液，加入Apollo 染液室温避光孵育30 min，PBS 洗除染液并用Hochest染核30 min。于荧光显微镜观察并随机获取5个视野的荧光图像，采用ImageJ软件对EdU阳性细胞计数，实验重复3次。

3.5 RT-qPCR 检测 mRNA 表达 细胞培养 24 h 后，收集细胞，按照试剂盒说明书提取细胞总RNA，测定样品纯度与浓度后将RNA逆转录为cDNA。在NCBI查询各基因的CDS，用Primer Premier 5.0 软件设计引物，序列见表1。以cDNA 为模板扩增各目的基因，反应条件为：95 ℃预变性2 min；95 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸 30 s，40 个循环，最后延伸10 min。目的基因的相对表达用2-ΔΔCt法分析。

表1 CD80、CD86、CD163、CD200R、Rap1A、PCNA、p27及GAPDH的引物序列Table 1. Primer sequences of CD80，CD86，CD163，CD200R，Rap1A，PCNA，p27 and GAPDH

3.6 Western blot 检测 p27、PCNA 和 Rap1A 蛋白的表达 细胞培养24 h 后提取细胞总蛋白，BCA 法检测样品中的蛋白浓度，取50 μg蛋白进行SDS-PAGE，再将蛋白转移至PVDF 膜，用5%脱脂奶粉封闭2 h，PBST洗膜10 min×3次，加入Ⅰ抗（p27、PCNA、Rap1A和β-actin 抗体，均按1∶1 000 稀释）4 ℃孵育过夜，次日回收Ⅰ抗，PBST 洗膜 10 min×3 次，再加入 HRP 标记的Ⅱ抗（1∶5 000）室温孵育2 h，充分洗膜后，加入ECL 发光液，显色、曝光，保存图片，以β-actin 为内参照，Image Lab软件进行定量分析。

3.7 ELISA法检测炎症因子IL-6和TNF-α浓度 收集细胞培养上清液，按照ELISA 说明书，在包被IL-6和TNF-α 抗体的96 孔板中前2 列每孔依次加入100 μL 标准工作液，其他每孔加入 100 μL 待测样品，给酶标板覆膜，37 ℃孵育90 min。将25×的浓缩洗涤液用双蒸水稀释后进行洗涤，随后每孔加入100 μL 生物素抗体工作液，37 ℃孵育60 min，洗涤后每孔加入100 μL酶结合工作液，进行孵育和洗涤，加入显色剂90 μL，混匀后37 ℃孵育30 min，最后每孔加终止液50 μL，终止反应，450 nm波长处检测各孔吸光度（A）值，根据标准曲线计算细胞内IL-6和TNF-α的浓度。

4 统计学处理

用GraphPad Prism 6.0 软件进行统计学分析，所有数据均以均数±标准差（mean±SD）表示。先评估数据是否为正态分布，再进行正态分布数据的方差齐性检验，方差齐的两组数据采用非配对t检验，多组数据的单因素比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA）。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 Hcy对ANA-1细胞增殖的影响

ANA-1 细 胞 经 100 μmol/L Hcy 刺 激 24 h 后 ，CCK-8 实验结果显示，Hcy 组的吸光度显著高于control组（P＜0.05），见图1A；EdU 染色结果显示，Hcy 组EdU 掺入 ANA-1 细胞核的量最多（P＜0.01），见图1B。

2 ANA-1 细胞中 p27 和 PCNA 的 mRNA 及蛋白表达变化

RT-qPCR 及 Western blot 结果显示，与 control 组相比，Hcy 组 p27 的 mRNA 及蛋白水平明显降低（P＜0.05），PCNA 的 mRNA 及蛋白表达水平均显著升高（P＜0.01），见图2。以上数据均表明Hcy促进ANA-1巨噬细胞增殖。

3 ANA-1细胞培养上清液中IL-6和TNF-α浓度

ELISA 结果显示，与 control 相比，Hcy 组 ANA-1细胞分泌IL-6 和TNF-α 水平显著升高（P＜0.05），见图3。这提示Hcy 促进ANA-1 细胞分泌炎症细胞因子IL-6和TNF-α。

4 Hcy对ANA-1细胞M1和M2极化标志物的影响

RT-qPCR 结果显示，与 control 相比，Hcy 组细胞的 M1 表型标志物 CD80 和 CD86 的 mRNA 表达显著增加（P＜0.05），见图4A、B，而M2 表型标志物CD163和CD200R 的 mRNA 表达显著减少（P＜0.05），见图4C、D，提示Hcy可有效促进ANA-1细胞M1极化。

Figure 1. Effects of Hcy on the proliferation of ANA-1 cells were detected by CCK-8 assay（A）and EdU staining（B；×200）. Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group.图1 Hcy对ANA-1细胞增殖能力的影响

Figure 2. Expression of p27 and PCNA in Hcy-treated ANA-1 macrophages. RT-qPCR（A）and Western blot（B）were used to detect the expression of p27 and PCNA. Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group.图2 Hcy处理的ANA-1细胞中p27和PCNA的表达情况

Figure 3. Effects of Hcy on the production of inflammatory cytokines from ANA-1 cells. A：the level of interleukin-6（IL-6）；B：the level of tumor necrosis factor-α（TNF-α）. Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group.图3 Hcy对ANA-1细胞产生炎性细胞因子的影响

Figure 4. Effects of Hcy on the polarization of ANA-1 cells. A and B：the mRNA levels of CD80 and CD86（M1 polarization markers）；C and D：the mRNA levels of CD163 and CD200R（M2 polarization markers）. Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group.图4 Hcy对ANA-1细胞M1和M2极化标志物的影响

5 Rap1A在ANA-1细胞中的表达变化

RT-qPCR 和 Western blot 结果显示，与 control 组相比，Hcy组Rap1A的mRNA和蛋白表达均显著增加（P＜0.05 或P＜0.01），见图5。以上结果说明，Hcy 能够促进Rap1A在ANA-1巨噬细胞中表达。

Figure 5. Effects of Hcy on the expression of Rap1A in ANA-1 cells. RT-qPCR（A）and Western blot（B）were used to detect the expression of Rap1A. Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group.图5 Hcy对ANA-1细胞中Rap1A表达的影响

6 Rap1A在Hcy诱导的ANA-1细胞增殖中的作用

为进一步验证Rap1A 是否调控Hcy 诱导的ANA-1 细胞增殖过程，将ANA-1 巨噬细胞转染AdshRNA/Rap1A，荧光显微镜观察感染效率达80%以上收集细胞进行下一步实验（图6A）；RT-qPCR 和Western blot 检测ANA-1细胞中Rap1A被干扰后自身表达的改变，结果如图6B、C 所示，ANA-1 细胞AdshRNA/Rap1A 转染成功。通过 CCK-8 实验和 EdU 染色检测ANA-1 细胞的增殖情况，结果显示，与Hcy+Ad-shRNA/GFP 组相比，Hcy+Ad-shRNA/Rap1A 组细胞增殖能力减弱，EdU 阳性细胞掺入量减少（P＜0.01），见图6D、E。进一步使用RT-qPCR 和Western blot 检测增殖相关蛋白p27 和PCNA 的表达改变，结果显示，与Hcy+Ad-shRNA/GFP 组相比，Hcy+AdshRNA/Rap1A 组细胞中 p27 的表达增加，PCNA 的表达降低（P＜0.05 或P＜0.01），见图7。该结果表明敲减Rap1A表达可缓解Hcy引起的ANA-1细胞增殖。

7 敲减Rap1A表达后ANA-1细胞M1及M2极化标志物的变化情况

为进一步明确Hcy 通过Rap1A 调控ANA-1 细胞的M1 极化，在ANA-1 细胞转染Ad-shRNA/Rap1A后，RT-qPCR 检测 M1 和 M2 极化标志物的 mRNA 水平。检测结果显示，与Hcy+Ad-shRNA/GFP 组相比，Hcy+Ad-shRNA/Rap1A 组的 M1 极化标志物 CD80 和CD86 表达水平显著降低（P＜0.01 或P＜0.05），见图8A、B，M2 极化标志物CD200R 的表达水平显著升高（P＜0.05），而 CD163 表达无明显变化，见图8C、D。该结果表明敲减Rap1A表达能够抑制ANA-1 细胞发生 M1 极化，说明 Hcy 通过 Rap1A 调控 ANA-1 细胞的M1极化。

Figure 6. Effect of Rap1A knockdown on the proliferation of ANA-1 cells. A：fluorescence microscopic observation of Ad-shRNA/Rap1A infection efficiency（×200）；B and C：RT-qPCR and Western blot were used to detect the expression of Rap1A in ANA-1 cells transfected with Ad-shRNA/Rap1A；D and E：CCK-8 assay and EdU staining（×200）were used to detect the effect of Rap1A on the proliferation of ANA-1 cells. Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs Hcy+Ad-shRNA/GFP group.图6 敲减Rap1A表达对ANA-1细胞增殖的影响

讨 论

Figure 7. Effects of Rap1A knockdown on the expression of proliferation-related proteins in ANA-1 cells. RT-qPCR（A and B）and Western blot（C and D）were used to detect the expression of p27（A and C）and PCNA（B and D）. Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs Hcy+Ad-shRNA/GFP group.图7 敲减Rap1A的表达对ANA-1细胞增殖相关蛋白表达的影响

Hcy 是一种在必需氨基酸甲硫氨酸代谢过程中形成的含硫氨基酸。正常情况下，血清Hcy 水平低于 5 μmol/L，当血清 Hcy 水平超过 15 μmol/L 时被称为HHcy［6］。Hcy 被认为是动脉粥样硬化和心血管疾病的独立危险因素［7-8］。Hcy有2种代谢途径，即转硫途径和转甲基途径，这也是Hcy 致病的病理生理学基础，其中，Hcy 通过转硫途径引起的氧化应激和免疫应答是Hcy 的致病机制之一［9］。由于巨噬细胞增殖和吞噬脂质变成泡沫细胞是As 的重要环节［10］，因此探讨Hcy 在巨噬细胞增殖中的机制具有重要的意义。本研究以ANA-1 巨噬细胞细胞为研究对象，以100 μmol/ L Hcy 刺激 ANA-1 巨噬细胞 24 h，成功构建巨噬细胞增殖模型。巨噬细胞增殖能力的增强与多种增殖基因表达的变化有关。p27 是细胞周期的负性调控分子，能够阻碍多种cyclin分子与激酶形成复合体，进而阻碍细胞周期进程、抑制细胞增殖［11］，PCNA 既是细胞核内DNA 多聚酶δ的辅因子、也是细胞周期发展的正性调控蛋白，能够加速DNA 复制及细胞周期进程，进而促进细胞增殖［12］。结果显示Hcy刺激ANA-1巨噬细胞后，p27的mRNA及蛋白表达水平显著降低，而PCNA的mRNA及蛋白表达水平显著升高，与文献报道一致。

巨噬细胞是免疫系统的重要组成部分，可通过吞噬外来微生物并提呈抗原［13］，在维持机体的内稳态平衡、对抗炎症反应、防御修复等过程中发挥重要作用，巨噬细胞表现出显著的可塑性，在不同的局部微环境下极化为不同的亚型，促炎的M1 型，即经典活化巨噬细胞；抗炎的M2型，即替代活化巨噬细胞。巨噬细胞这种不同表型的转换调控者炎症相关疾病的发生、发展和转归［14］。CD80、CD86 和MHCⅡ等细胞表面分子在M1 型巨噬细胞高表达，M1 型细胞激活后可以分泌TNF-α 和IL-6 等炎症因子，通过产生趋化因子激活Th1 型免疫反应，诱导炎症反应［15］；而CD200R、CD163 和 CCL13 等细胞表面分子在 M2 型巨噬细胞高表达，M2 型细胞激活后释放大量抑炎型细胞因子如IL-4 和IL-10 等，激活Th2 型免疫反应，促进炎症的消除和组织损伤修复［16］，本研究结果显示，M1 型巨噬细胞表面分子CD80 和CD86 的表达也明显增加，而M2 型细胞表面分子CD200R 和CD163表达显著降低，表明Hcy 能够促进ANA-1 巨噬细胞释放炎症因子，并诱导其发生M1极化。

Figure 8. Effects of Rap1A knockdown on M1 and M2 polarization of ANA-1 cells. A and B：the mRNA levels of CD80 and CD86（M1 polarization markers）；C and D：the mRNA levels of CD163 and CD200R（M2 polarization markers）. Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs Hcy+Ad-shRNA/GFP group.图8 敲减Rap1A表达对ANA-1细胞M1及M2极化标志物表达的影响

Rap是肿瘤基因家族成员之一，广泛分布于各种组织细胞中，与细胞的增殖、极性的形成、分化、粘附、运动等多种生物学功能密切相关［17-18］。Rap 是一种小GTP酶，可以通过活性改变调控其功能［19］。Rap家族有两个亚类，Rap1 和Rap2，其中Rap1 有含有2个亚型，Rap1A 和Rap1B，二者序列存在95%的同源性［20］。研究发现，miRNA 抑制 Rap1A 的表达则能促进肝癌细胞凋亡，表明Rap1A 参与细胞的增殖过程［21］。另有研究发现，PI3 激酶 γ 促进 Rap1A 介导的髓系细胞整合素α4β1 活化，导致肿瘤炎症和生长［22］；HBV 感染通过上调 miR-203a 从而靶向抑制Rap1A 的表达，影响 PI3K/ERK/p38/NFκB 通路，诱发肝炎，提示Rap1A 参与了机体的免疫应答过程［23］。本研究结果显示：Hcy 干预ANA-1 巨噬细胞后，Rap1A 的表达明显增加，表明Rap1A 可能参与Hcy导致的巨噬细胞免疫应答过程。为了进一步明确Rap1A 在Hcy 诱导的巨噬细胞增殖和极化中的作用，我们将Rap1A干扰腺病毒转染至ANA-1 巨噬细胞，结果发现，干扰Rap1A的表达不仅可以逆转由Hcy 诱导的巨噬细胞增殖，还可以使M1 型巨噬细胞表面分子CD80 和CD86 的表达减少，M2 型细胞表面分子CD200R 表达显著增加，但M2 标志物CD163 表达无明显变化，表明Rap1A 是Hcy 致巨噬细胞增殖及M1极化的重要机制。

综上所述，Hcy 能够促进ANA-1 巨噬细胞增殖和M1 极化，其机制可能与Hcy 上调Rap1A 的表达有关，我们的研究提示，以Rap1A 为靶标调控巨噬细胞的增殖与炎症反应，可能对临床HHcy相关疾病的治疗提供理论依据。