张丽娜， 谢中杰， 金 慧， 张振刚， 李如君△

（1扬州大学附属医院心内科，江苏扬州225001；2台州市第一人民医院心内科，浙江台州318020）

以急性心肌梗死为代表的心血管疾病已成为威胁国民健康的主要病因之一［1］。虽然心肌再灌注治疗已普遍开展，但临床上仍存在恢复血供的心脏收舒功能恶化和恶性心律失常等损伤加重的现象，这与心肌缺血再灌注损伤（myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI）密切相关［2-3］。研究证实，心肌再灌注时核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）炎症小体［包括含caspase 募集结构域的凋亡相关斑点样蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain，ASC）和caspase-1］活化并引发以白细胞介素（interleukin，IL）-1β/18 产生为特征的强烈无菌性炎症反应，是导致MIRI 的重要病理生理学基础，因而调控NLRP3 炎症小体可能是减轻MIRI 的新型手段［4-5］。我们的前期实验表明，增强细胞或组织中O-连接的N-乙酰葡萄糖胺（O-linkedN-acetylglucosamine，O-GlcNAc）修饰（O-GlcNAcylation）水平，在急性应激损伤过程中具有显著的抑制炎症反应的作用［6］。但O-GlcNAc 修饰是否通过调控 NLRP3 炎症小体发挥抗炎作用以及对MIRI 的影响尚不清楚。因此，本研究通过H9c2 大鼠心肌细胞缺氧再复氧（hypoxia/reoxygenation，H/R）损伤建立MIRI 的细胞模型，通过重组腺病毒感染细胞方式过表达OGlcNAc 转移酶（O-GlcNAc transferase，OGT）以提高细胞内O-GlcNAc 修饰水平，探讨其对细胞H/R 的影响及可能机制，以期为MIRI 的预防和治疗提供潜在的分子干预靶标和参考资料。

材料和方法

1 材料

H9c2 大鼠心肌细胞购自中国科学院上海生命科学院细胞库；OGT 过表达腺病毒（Ad-OGT）和空载对照腺病毒（Ad-Null）为本实验室保存；Trizol 和RIPA 裂解液购自中国北京普利莱基因技术有限公司；O-GlcNAc（CTD110.6）抗体、OGT 抗体、GAPDH 抗体、IgG 和 Protein A/G plus Agarose 购自 Santa Cruz；IL-1β、IL-18 抗体和 HRP 标Ⅱ抗购自 Cell Signaling Technology；NLRP3 抗体、ASC 抗体和 caspase-1 抗体购自 Abcam；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、TUNEL 凋亡试剂盒、DAPI 和BCA 蛋白定量试剂盒购自中国上海碧云天生物技术有限公司；增强型ECL 化学发光液、反转录cDNA 合成试剂盒、SYBR Green 荧光定量试剂盒、DMEM 培养液和胎牛血清购自Thermo；PCR 引物由中国上海生工生物工程有限公司合成；RT-qPCR 扩增仪（ABI 7500）；Wester blot 成像系统（iBrightCL 1500）。

2 方法

2.1 H9c2大鼠心肌细胞培养 冻存的H9c2大鼠心肌细胞复苏后用含10%胎牛血清的DMEM 培养液重悬并置于体积分数5% CO2、常氧、37 ℃培养箱中绝对静置培养，待细胞融合度达80%左右时用0.25%胰酶消化液消化传代，选用对数生长期的细胞行相应实验。

2.2 病毒预处理 将细胞传至3.5 cm 直径培养皿培养至融合度约50%时，取感染复数为20（MOI=20）剂量的Ad-OGT 感染细胞48 h 以提高细胞内O-GlcNAc修饰水平，并设置Ad-Null感染组作为对照。

2.3 实验分组 将感染病毒后细胞分为原生OGlcNAc修饰水平的常氧对照组（Ad-Null+Ctrl组）、H/R 组（Ad-Null+H/R 组）及高O-GlcNAc 修饰水平的常氧对照组（Ad-OGT+Ctrl 组）、H/R 组（Ad-OGT+H/R组）。通过将病毒预处理的细胞血清饥饿过夜后放置于5%CO2、94%N2、37 ℃培养箱中缺氧6 h，移置于5% CO2、常氧、37 ℃培养箱中复氧 12 h 建立 H/R模型［5］。

2.4 LPS 诱导NLRP3 炎症小体表达 将病毒预处理的细胞血清饥饿过夜，分为原生O-GlcNAc 修饰水平的对照组（Ad-Null+Veh 组）、LPS 刺激组（Ad-Null+LPS 组）及高O-GlcNAc 修饰水平的LPS 刺激组（Ad-OGT+LPS 组）。参考已有文献中LPS 使用浓度［7］，以0.1 mg/L 终浓度的LPS 处理细胞12 h 以诱导NLRP3炎症小体的表达，再次验证O-GlcNAc 修饰对NLRP3炎症小体的影响。

2.5 RT-qPCR 检测细胞炎症细胞因子mRNA 表达 采用Trizol 按说明提取各组细胞总RNA。紫外分光光度计测定浓度和纯度后，各组取600 ng 总RNA为模板反转录为cDNA，行RT-qPCR。引物序列如 下 ：IL-1β 的 上 游 5′-GGCGGTTCAAGGCATAACAGGCT-3′，下 游 引 物 序 列 为 5′-CAGCCCAAGTCAAGGGCTTGGA-3′；IL-18 的上游引物序列为 5′-AAGAACAAGATCATTTCCTTTGAGGA-3′，下游引物序 列 为 5′-GGAACACGTTTCTGAAAGAATATGAG-3′；18S（内参照）的上游引物序列为5′-GAAACGGCTACCACATCC-3′，下 游 引 物 序 列 为 5′-CACCAGACTTGCCCTCCA-3′。PCR 结果采用 2-ΔΔCt法进行分析。

2.6 TUNEL 染色检测细胞凋亡损伤 采用一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂按说明对细胞进行凋亡染色，DAPI 复染细胞核，在荧光倒置显微镜下观察，每组细胞随机记录4 个视野的画面并计算凋亡阳性细胞比率。

2.7 Western blot检测细胞蛋白表达 采用RIPA 裂解液提取细胞总蛋白经BCA 法定量后，每样品取20 μg 总蛋白进行SDS-PAGE（10%分离胶、5%浓缩胶）电转至PVDF 膜上，5%脱脂奶粉常温封闭90 min，分别加入相应Ⅰ抗4 ℃孵育过夜，洗膜后用HRP 标记相应Ⅱ抗常温孵育90 min，ECL 化学发光后使用iBrightCL 1500曝光显影；ImageJ软件进行定量分析，结果以目的条带与内参条带灰度的比值显示。

2.8 蛋白质免疫共沉淀（Co-IP）检测细胞内蛋白相互作用 采用Co-IP 裂解液提取细胞总蛋白经BCA法定量后，每样品取600 μg 总蛋白分别使用NLRP3和ASC 抗体进行特异性免疫吸附，再经与Protein A/G plus Agarose 结合后离心共沉淀，将共沉淀产物清洗后经上样缓冲液100 ℃变性后离心，取上清后行Western blot 检测目的蛋白表达，同时设normal mouse IgG IP阴性对照。

3 统计学处理

采用SPSS 16.0软件进行统计分析，数据结果以均数±标准误（mean±SEM）表示，两组间均数比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 H/R 对H9c2 大鼠心肌细胞内O-GlcNAc 修饰水平的影响

与 Ad-Null+Ctrl 组相比，Ad-Null+H/R 组细胞内OGT 表达及O-GlcNAc 修饰水平显著降低（P＜0.05）；Ad-OGT+Ctrl 组 OGT 及O-GlcNAc 修饰水平显著高于Ad-Null+Ctrl 组（P＜0.05）；且Ad-OGT+H/R 组OGT 及O-GlcNAc 修饰水平也显著高于Ad-Null+H/R 组（P＜0.05），见图1。

Figure 1. Over-expression of OGT increase global O-GlcNAcylation level in the cells. The levels of O-GlcNAc and OGT were detected by Western blot. Mean±SEM. n=3.*P＜0.05 vs Ad-Null+Ctrl group；#P＜0.05 vs Ad-Null+H/R group.图1 过表达OGT提高细胞全局O-GlcNAc修饰水平

2 O-GlcNAc 修饰对H/R 介导细胞炎症反应和细胞凋亡的影响

与 Ad-Null+Ctrl 组相比，Ad-Null+H/R 组炎症细胞因子 IL-1β 和 IL-18 mRNA 大量转录合成（P＜0.05），并出现显著细胞凋亡现象，细胞凋亡率由（2.6±0.8）%上升至（62.8±4.2）%；Ad-OGT+H/R 组IL-1β 和 IL-18 转录 水 平 显 著 低 于 Ad-Null+H/R 组（P＜0.05），且细胞凋亡率由（62.8±4.2）%下降至（27.4±3.9）%，见图2、3。

Figure 2. Increased O-GlcNAcylation level alleviated H/R-induced IL-1β and IL-18 mRNA expression. The IL-1β and IL-18 mRNA expression levels in H9c2 cells were detected by RT-qPCR. Mean±SEM. n=5.*P＜0.05 vs Ad-Null+Ctrl group；#P＜0.05 vs Ad-Null+H/R group.图2 提高细胞内O-GlcNAc修饰水平可降低H/R诱导的IL1-β和IL-18 mRNA表达

Figure 3. Increased O-GlcNAcylation level alleviated H/R-induced cell apoptosis. Apoptosis was detected by TUNEL-FITC（green）and DAPI（blue）staining. The scale bar=25 μm. Mean±SD. n=5.*P＜0.05 vs Ad-Null+Ctrl group；#P＜0.05 vs Ad-Null+H/R group.图3 提高细胞内O-GlcNAc修饰水平降低H/R诱导的细胞凋亡

3 O-GlcNAc 修饰对 H/R 介导 NLRP3 炎症小体表达的影响

与 Ad-Null+Ctrl 组相比，Ad-Null+H/R 组 NLRP3炎症小体组成蛋白NLRP3、ASC 和caspase-1 及其效应产物IL-1β 和IL-18 表达增多（P＜0.05）；Ad-OGT+H/R 组 NLRP3、ASC 和 caspase-1 表 达 水 平 与 Ad-Null+H/R 组比较并统计学差异（P＞0.05），但炎症细胞因子 IL-1β 和 IL-18 表达水平较 Ad-Null+H/R 组显著降低（P＜0.05），见图4。

4 O-GlcNAc 修饰对NLRP3 炎症小体功能状态的影响

与 Ad-Null+H/R 组相比，Ad-OGT+H/R 组与 NLRP3 相结合的 ASC 和 caspase-1 显著减少，且 NLRP3免疫沉淀物O-GlcNAc 修饰水平升高（P＜0.05）；而两组中ASC 免疫沉淀物O-GlcNAc 修饰水平无显著差异（P＞0.05），未检测到O-GlcNAc 修饰的 NLRP3 信号条带，见图5。

5 再次验证O-GlcNAc 修饰对NLRP3 炎症小体表达和功能状态的影响

与 Ad-Null+Veh 组相比，Ad-Null+LPS 组和 Ad-OGT+LPS 组均观察到 NLRP3、ASC 和 caspase-1 的大量诱导表达（P＜0.05），3 种蛋白的表达水平在后两组间并无统计学差异（P＞0.05），见图6。而与Ad-Null+LPS 组相比，Ad-OGT+LPS 组与 NLRP3 相结合的ASC 和caspase-1减少，免疫沉淀物的O-GlcNAc 修饰水平升高（P＜0.05）；两组间ASC 免疫沉淀物的OGlcNAc 修饰水平无显著差异（P＞0.05），并在NLRP3分子量118 kD附近位置无信号条带，见图7。

Figure 4. Increased O-GlcNAcylation level by over-expression of OGT had no effect on the expression of NLRP3，ASC and caspase-1（A）but reduced the expression of IL-1β and IL-18（B）induced by H/R injury. The levels of NLRP3，ASC，caspase-1，IL-1β and IL-18 were detected by Western blot. Mean±SEM. n=5.*P＜0.05 vs Ad-Null+Ctrl group；#P＜0.05 vs Ad-Null+H/R group.图4 提高细胞内O-GlcNAc修饰水平对H/R诱导的NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1β和IL-18表达的影响

讨 论

NLRP3 炎症小体是由 NLRP3、ASC 和 caspase-1蛋白所形成的大型蛋白复合体，在心肌缺血及再灌注过程中可被诱导表达和活化，并促使IL-1β 和IL-18 成熟和分泌［8］，所引发的炎症反应和细胞焦亡已被证实在MIRI 及实质性脏器缺血再灌注损伤发生发展过程中发挥重要作用［4，9］。但完全敲除NLRP3或阻断NLRP3炎症小体的表达却观察到了心肌梗死面积增大这一负面结果［10-11］。因而除了调节表达含量手段外，如何快速精细调控NLRP3 炎症小体功能成为聚焦重点。

Figure 5. Increased O-GlcNAcylation level prevented the interactions of ASC and caspase-1 with NLRP3 induced by H/R injury（A）and directly increased the O-GlcNAcylation level of NLRP3 instead of ASC（B）. The binding degree of ASC and caspase-1 with NLRP3 and modified status of NLRP3 and ASC were detected by Co-IP. Mean±SEM. n=3.*P＜0.05 vs Ad-Null+H/R group.图5 提高细胞内O-GlcNAc 修饰水平可直接增强NLRP3 的O-GlcNAc 修饰并阻碍H/R 诱导的ASC、caspase-1 和NLRP3 相结合

Figure 6. Increased O-GlcNAcylation level had no effect on the expression of NLRP3，ASC and caspase-1 induced by LPS. The protein levels of NLRP3，ASC and caspase-1 were detected by Western blot. Mean±SEM. n=5.*P＜0.05 vs Ad-Null+Veh group.图6 提高细胞内O-GlcNAc修饰水平对LPS诱导NLRP3、ASC和caspase-1表达的影响

本研究结果表明，提高H9c2大鼠心肌细胞内OGlcNAc 修饰水平，虽没有抑制H/R 诱导的NLRP3 炎症小体组成蛋白NLRP3、ASC 和caspase-1的表达，但显著降低了NLRP3 炎症小体活化后效应产物IL-1β和IL-18 的表达，从而缓解了H/R 诱导的炎症反应及细胞凋亡，提示NLRP3 炎症小体活化及其生物学功能受到负性调控。免疫共沉淀证实，提高O-GlcNAc修饰水平导致NLRP3 与ASC 和caspase-1 的相互结合受阻。由于NLRP3 只有与ASC 和caspase-1 相继结合并形成蛋白复合体（炎症小体）才能活化并发挥生物学功能，因此这种负性调控作用与阻碍三者相互结合密切相关。为验证是否因NLRP3炎症小体某种组分发生O-GlcNAc 修饰所致，我们进一步检测了NLRP3 免疫共沉淀物（由NLRP3 抗体沉淀）的OGlcNAc修饰水平，显示沉淀物的O-GlcNAc修饰程度随着细胞内O-GlcNAc 修饰水平提高直接得到增强；而NLRP3 炎症小体另一主要组分ASC 沉淀物（由ASC 抗体沉淀）的O-GlcNAc 修饰水平无显著变化，初步表明NLRP3发生O-GlcNAc 修饰的可能性最大；且未检测到与ASC相结合的沉淀物中存在NLRP3分子量的O-GlcNAc 信号条带，提示NLRP3 发生OGlcNAc 修饰很可能阻碍了NLRP3 炎症小体的组装激活。我们再次利用经典的TLR4 激动剂LPS 诱导NLRP3 炎症小体表达活化，同样验证了提高OGlcNAc 修饰水平对 NLRP3 与 ASC 和 caspase-1 相互结合的抑制作用，以及对NLRP3蛋白O-GlcNAc 修饰水平的直接提升作用。以上结果表明，除了经典的表达丰度调控方式外，通过调节翻译后修饰（posttranslational modifications，PTMs）状态，也是 NLRP3炎症小体一种快速而重要的调控方式。已证实NLRP3 炎症小体可受到多种PTMs 的调控，如多种酪氨酸激酶 Syk、Jnk 和 Btk 介导的 ASC 磷酸化能够促进NLRP3 炎症小体的活化［12-13］；受体 TLR4 通过激活髓分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）促进NLRP3 去泛素化是NLRP3 炎症小体活化的重要起始环节［14］；E3 泛素连接酶 FBXL2 通过促进 NLRP3 Lys689位点泛素化降解从而抑制NLRP3 炎症小体的组装［15］，但NLRP3炎症小体能否被O-GlcNAc 修饰尚未明确报道。

Figure 7. Increased O-GlcNAcylation level prevented the interactions of ASC and caspase-1 with NLRP3 induced by LPS（A）and directly increased the O-GlcNAcylation level of NLRP3 so that this modified status cannot be combined with ASC（B）. The binding degree of ASC and caspase-1 with NLRP3 and modified status of NLRP3 and ASC were detected by Co-IP. Mean±SEM. n=3.*P＜0.05 vs Ad-Null+LPS group.图7 提高细胞内O-GlcNAc 修饰水平通过直接增强NLRP3 的O-GlcNAc 修饰并阻碍LPS 诱导的ASC、caspase-1 和NLRP3相结合

同磷酸化修饰、泛素化修饰一样，O-GlcNAc 修饰广泛发生于生物体内，不同的是参与O-GlcNAc 修饰调控的酶现已发现的仅有OGT 和OGA（O-乙酰氨基葡萄糖苷酶）两种。OGT 能够催化GlcNAc 的供体二磷酸尿嘧啶GlcNAc（uridine diphosphateN-acetylglucosamine，UDP-GlcNAc）以氧-糖苷键的形式共价结合到底物蛋白丝氨酸/苏氨酸（Ser/Thr）侧链羟基上从而增加底物O-GlcNAc修饰水平；而OGA可特异性水解氧-糖苷键降低底物O-GlcNAc 修饰水平［16］，因而本研究采用过表达OGT 以达到提高O-GlcNAc 修饰水平的目的。

在多种应激损伤过程中均观察到机体OGlcNAc 修饰水平的快速变化，是公认的细胞内营养及应激压力感受器［17］。通过短期内快速提高机体OGlcNAc 修饰水平，表现出细胞保护作用，能够增强机体对应激损伤的抗打击能力［18-19］。我们课题组前期研究显示，短期内提高细胞或组织的O-GlcNAc 修饰水平可通过调节NF-κB 炎症信号通路中的多个环节来发挥抑制炎症应答的作用。例如，直接增强NF-κB p65亚基的O-GlcNAc修饰水平能够干扰p65的磷酸化激活［20］；能够增强抗炎因子 A20 对 NF-κB 炎症信号通路的负反馈抑制作用［6］。国外有学者进一步证实O-GlcNAc修饰的p65亚基无法核内移并影响靶基因转录，减少组织中 IL-1β 和 TNF-α 的表达，显著减少大脑缺血再灌注损伤后的脑梗死面积［21］。NLRP3 炎症小体作为NF-κB 炎症信号通路的重要组成环节［22］，能够直接促进炎症细胞因子 IL-1β 和 IL-18的表达和分泌，而通过上调NLRP3的O-GlcNAc 修饰水平能够抑制IL-1β、IL-18 mRNA 的转录进一步表明NLRP3 炎症小体还可能是O-GlcNAc 修饰调控NF-κB炎症信号通路的又一潜在靶点。

综上所述，在本研究中我们首次获得了NLRP3被O-GlcNAc 修饰的证据。NLRP3 发生O-GlcNAc 修饰后可阻碍H/R 诱导的NLRP3 炎症小体的组装活化，减少效应产物IL-1β 和IL-18的表达，从而缓解细胞的炎症损伤。但由于免疫沉淀除NLRP3外还包含了与其相结合的其它蛋白，且尚未开发出直接检测NLRP3 发生O-GlcNAc 修饰的方式，因此我们课题组接下来将进一步验证NLRP3 炎症小体活化时发生O-GlcNAc 修饰的相关蛋白及可能位点。期望为心肌缺血再灌注损伤的预防与治疗提供可能的干预靶标和参考资料。