李 优,南新营,李耀东

青海大学,西宁 810016

高原低氧适应是指长期生活在高原环境中的物种经过长期的适应自然所发生的自然选择,可以发生使其自身适应高原低氧的环境[1]。在长期自然选择过程中留下了能适应高原环境的物种,这些动物机体发生了一些不可逆的,能稳定遗传的变化[2],这些变化引起了学者的注意。高原动物成为高原低氧适应研究的理想模型,很多研究人员选择用世居于高原的动物作为研究对象[3],如喜马拉雅旱獭、藏鸡[4]、高原鼢鼠[5]、雪鸡[6]等。喜马拉雅旱獭是青藏高原地区特有的野生动物资源,具有许多平原动物不具备的生物学特性,目前对于喜马拉雅旱獭的研究具有很高的实际意义,可以加速对高原动物的认识。

D-loop区是线粒体控制区,为非编码区,此区域可以将基因突变进行累积,因此此区域是线粒体基因组变异最快和长度变异最大的区域。现有研究表明,D-loop区的变异与高原低氧适应有着重要相关性[7]。

1 喜马拉雅旱獭的生物学特征

世界上已知的旱獭种类有14种,中国有四种。在中国的四种旱獭中,喜马拉雅旱獭是分布最广,居住地区海拔最高的旱獭之喜马拉雅旱獭(Marmota Himalayan)属松鼠科(Sciuridae),啮齿类(Rodenti),旱獭属,是高原环境中的世居动物,也是高原环境中的特有物种,主要分布于我国青海,西藏,云南等地以及位于青藏高原边缘山地[8]。由于喜马拉雅旱獭长期生活在高原地区,因此这一物种对于低氧的环境有很好的适应性：在高原低氧的环境中,喜马拉雅旱獭线粒体DNA中的D-loop区发生了关于高原低氧适应的变异[9],这种变异为研究高原动物低氧适应遗传机制奠定基础[10]。

2 喜马拉雅旱獭线粒体DNA D-loop区的生物学功能及结构特征

线粒体是存在于真核细胞内的细胞器。在生物体内,细胞的代谢水平与线粒体的数目有关,生物体的代谢活动越旺盛,线粒体数目越多[11-12]。线粒体在生物体中发挥维持机体的能量代谢、调节细胞凋亡、生成活性氧等多种生物学功能[13]。

线粒体内含有DNA,线粒体DNA是闭合,环状的双链DNA分子,是独立的核外基因。线粒体DNA具有进化速度快,结构稳定,易于研究等特点,因此线粒体DNA是研究种群遗传结构的理想材料。线粒体D-loop区是mt-DNA复制与转录的关键部位,因此又被称为线粒体控制区[14]。D-loop区在线粒体中占6%左右,是线粒体的非编码区。不同物种D-loop区差异较大,所含有的碱基数从几百个到几千个不等。同一物种不同个体的D-loop区也有差异：通过近些年的研究发现大多数脊椎动物的D-loop区位于编码脯氨酸与苯丙氨酸tRNA的基因之间,飞禽类的D-loop区位于编码脯氨酸和谷氨酸 tRNA 的基因之间。D-loop区是细胞核相互联络的重要区域,它既是H链合成的起始子,又可以将H链序列显示出来,显示出的H链序列易被特异分子特异性结合。

3 喜马拉雅旱獭高原低氧适应相关基因

喜马拉雅旱獭的完整基因序列显示喜马拉雅旱獭的完整mt基因组长度为16,443 bp,包含13个蛋白质编码基因,2个核糖体RNA(rRNA)基因,22个转移RNA(tRNA)基因和一个典型的控制区(CR)[15]。这几种不同类型的基因及其数量与之前在大多数脊椎动物mt基因组中发现的相同。通过近些年对喜马拉雅旱獭的研究,发现在其mtDNA中存在与高原低氧适应有关的基因有37个,有如COX1、COX2、COX3、ND1、ND2、ND3[2]、ATPase6、ATPase8等[16-17]。在这些与低氧相关机制调控有关的基因中,有8个tRNA基因和ND6基因编码在l-链上,其余28个基因编码在h-链上。

4 喜马拉雅旱獭的国内外研究进展

在线粒体DNA上,D-loop区属于高变区,生物体的变异大部分发生在此区域。高原上的生物发生的低氧适应的基础可以基于此进行遗传分化的研究[18-19],系统发育的研究以及物种间亲缘关系的研究。对于喜马拉雅旱獭的研究近些年来主要集中于以下几方面：

4.1 喜马拉雅旱獭起源与分化研究

在闫京艳,陈洪舰等人在青藏高原喜马拉雅旱獭亚种分化的遗传学证据一文中,通过对喜马拉雅旱獭样本进行基因与11个微卫星标记的检测和分析,得到了观测杂合度大于期望杂合度的结果,等位基因在两个群体中分布不均匀。通过最大似然法和贝叶斯推断得出系统发育分析,结果显示所有获得的cytb单倍型在根部以较高的支持率聚为两个单系群,并分别对应两个已知亚种。经Beast分析,两个单系群的分化时间与该属的另外两个种的分化时间相同。基于微卫星分析检测到两个喜马拉雅旱獭的单系群之间具有明显的基因流,这表明两个单系群之间没有明显的生殖隔离,其分化仍只是亚种水平[20]。该研究第一次系统性地证实了喜马拉雅旱獭两个亚种的存在[21]。

张爱萍等[22]人在对其青海地区喜马拉雅旱獭疫源地鼠疫菌基因组时空演变及其生态适应进行分析,通过抽样选取青海省的喜马拉雅旱獭疫源地得到的鼠疫菌株,对其基因组型DFR数据进行分析,采用基因组分型和空间流行病学方法,绘制鼠疫菌基因组DFR时空演变专题地图,综合分析鼠疫菌基因组时空演变特征及其趋势,目的是探讨青海地区喜马拉雅旱獭疫源地在鼠疫菌基因组时空演变及其影响因素,得出青海地区疫源地喜马拉雅旱獭鼠疫菌DFR分型有较明显的时空差异的结论。在空间尺度上喜马拉雅旱獭的型号分布受到地区的影响。在时间尺度上,各地分离到的鼠疫菌基因组DFR型均有不同程度的种群替代。

马怀雷等[23]在会议中指出,通过对喜马拉雅旱獭生态学的研究,可以制定相应策略,这对于控制动物间的疫情具有重要意义。此研究用微卫星标记法对喜马拉雅旱獭家族之间个体的迁徙及地理之间的阻隔对迁徙的影响作了初步探索。首先采用磁珠富集筛选得到喜马拉雅旱獭多态性微卫星位点。通过分析得出,喜马拉雅旱獭在自然灾害面前受到的影响较小。有八个家族Fst值小于0.2,说明家族之间存在着广泛的基因交流,未产生明显的遗传分化。

4.2 喜马拉雅旱獭组织学研究

刘海青在喜马拉雅旱獭血液生化指标测定一文中用喜马拉雅旱獭血液作为研究对象。动物血液生化值可以反应器官功能等指标,因此近些年通过对于喜马拉雅旱獭的血液生化值的研究进而为其临床疾病的诊断与治疗、动物实验和模型建立等研究提供参考依据[24]。研究结果显示,喜马拉雅旱獭可用于建立人类乙肝动物模型,心血管病和肥胖病,此次研究初步建立人工饲养下的喜马拉雅旱獭血液生化指标,为以后喜马拉雅旱獭饲养管理及疫病监测提供了参考依据。

在新疆喀什喜马拉雅旱獭病毒组研究一文中,孙悦等[25]通过对新疆喜马拉雅旱獭的肠道为研究对象,通过应用宏转录组法(MTT)、宏基因组法(MTG)、序列不依赖扩增法(SIA)、多重替代扩增法(MDA)对肠道样品进行病毒基因组学研究。通过上述四种方法喜马拉雅旱獭肠道对样品处理,发现了30个科的病毒,再对这些病毒进行检测,得到病毒组详细信息,为人类认识动物携带病毒的多样性做出了贡献。

4.3 喜马拉雅旱獭的实验动物学研究

近年来,有学者已证实喜马拉雅旱獭可以作为动物模型,在此基础上可以研究人类乙肝病毒的发病机制,还可以通过建立实验动物学模型,筛选出抗病毒的药物。在动物实验技术在喜马拉雅旱獭实验研究中的应用一文中,通过探索实验动物技术在喜马拉雅旱獭研究过程中的可操作性并进行验证,成功建立了关于喜马拉雅旱獭的实验动物技术模型[26],在喜马拉雅旱獭的研究实现技术上的支持。其次,范薇在国内首次采用活体旱獭肝脏穿刺技术,用于肝脏组织的提取,填补了活体旱獭肝脏穿刺获取组织的空白[27]。

4.4 喜马拉雅旱獭基于D-loop区的多态性及群体结构研究

近年来,分子水平上对线粒体基因控制区即D-loop区的研究主要集中于多态性及物种的发育分析。在喜马拉雅旱獭线粒体 DNA 控制区遗传多样性及系统发育一文中,马英和李海龙等人对喜马拉雅旱獭的遗传背景进行分析,以云南、青海、西藏的旱獭作为研究对象,将获得的线粒体D-loop区的部分基因序列进行PCR扩增,再运用遗传学方法对获得的样本进行遗传多样性分析。喜马拉雅旱獭在mtDNA D-loop 区积累了较丰富的变异,核苷酸变异类型丰富。在研究种群遗传关系和结构时用基因分化和基因流来进行评估,结果显示不同地理环境中种族基因交流较少,出现明显的基因分化。BAO Z Q等通过对原鼠群、高原鼠群、喜马拉雅旱獭群位于D-loop区的ND3蛋白和cytB蛋白进行比较研究,发现喜马拉雅旱獭群的ND3蛋白在适应高原上的生活中起着重要作用,并在分子水平上显示出与其他高海拔动物共同进化的历史。探索其是否有收敛进化[28]。

5 前景与展望

D-loop区在线粒体DNA中是高变区[29],在喜马拉雅旱獭进化中自然选择留下了可以适应高原低氧环境的变异,通过研究这些变异,对于揭示喜马拉雅旱獭的进化以及遗传分化有重要的价值[30]。D-loop区将为阐明喜马拉雅旱獭的系统发育关系、遗传结构和母体起源提供有用的信息[31-33]。为了全面了解高原动物的遗传变异机制,还应结合其他方面如核DNA、动物体貌、染色体等。随着学者对于D-loop区的研究,以及生物技术的发展,关于喜马拉雅旱獭的高原低氧适应的机制与原理也会在基因水平上一步一步揭开。