杨 帆， 刘 晓， 王之可， 李素霞

（1. 华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室，上海 200237；2. 上海雅心生物技术有限公司，上海 200231）

Kex2 蛋白酶是一种钙离子依赖型的丝氨酸蛋白酶，可以特异性识别两个连续的碱性氨基酸并在第二个碱性氨基酸的羧基端肽键进行切割[1-3]。Kex2 蛋白酶包含814 个氨基酸残基，分为7 个结构域：信号肽（1～19 氨基酸残基）、前肽（20～113 氨基酸残基）、催化结构域（114～410 氨基酸残基）、P 结构域（411～624 氨基酸残基）、丝氨酸/苏氨酸富集区（625～679 氨基酸残基）、跨膜区（680～699 氨基酸残基）以及胞浆区（700～814氨基酸残基）[4-5]。研究发现信号肽、跨膜区和胞浆区这3 个结构域与Kex2 蛋白酶的活性无关，去除这些结构域不会影响蛋白酶的活性，因此在表达时通常只表达前肽至丝氨酸/苏氨酸富集区这4 个结构域的氨基酸片段[6-9]。

Kex2 蛋白酶在生物医药行业有广泛应用前景，相比胰蛋白酶，Kex2 酶切位点更特异。为了能够得到高产量的Kex2 蛋白酶，研究人员尝试了多种不同类型的表达系统，结果表明毕赤酵母表达系统表达Kex2 蛋白酶效率最高[10-13]。本实验室成功利用毕赤酵母表达系统表达了含有Kex2 前肽、催化结构域、P 结构域和丝氨酸/苏氨酸富集区结构域的20～667 位氨基酸残基序列，利用毕赤酵母α-信号肽取代原Kex2 信号肽（1～19 氨基酸残基），可以得到直接分泌到胞外的目的蛋白[14]。然而在纯化过程中发现，Kex2 蛋白酶会出现自降解的现象，产生多条杂条带，酶活性降低。在分析其氨基酸序列后发现，Kex2 蛋白酶自身结构中含有多对连续碱性氨基酸残基位点，这可能是导致其自降解的原因。……