丁 洋，杨志琦，丁 妮，张晓燕，李明皓

肝细胞肝癌(HCC)是最为常见的恶性肿瘤，该肿瘤有高发病率，高病死率，极易复发和转移的特质[1-2]。上皮间质转化(EMT)是目前研究比较清楚的一种恶性肿瘤产生迁移和侵袭的机制[3]。上调基因4(URG4)是大数据时代发掘出的一种全新的癌基因，研究表明，该基因能够在多种类型的肿瘤中表达[4-5]。Hep3B细胞中能够检测到URG4高表达，并且具有正向调节Hep3B细胞侵袭、转移的功能[6]。因此，本研究拟研究下调Hep3B细胞内URG4基因表达的水平，能否调节肝脏恶性肿瘤细胞的迁移，侵袭能力以及对EMT机制中关键蛋白TGF-β、E-cadherin表达的影响。为进一步了解肝癌的发生、发展提出新的思路，并对其诊断、治疗提出新的观点。

1 资料与方法

1.1 一般资料:人肝细胞癌(HCC)细胞系Hep3B购自美国ATCC。DMEM培养基和FBS购自美国Gibco。靶向URG4的siRNA(siURG4)或非特异性对照siRNA(siNC)购自上海Genechem公司。基质胶购自BD。TRIzol试剂购自美国Invitrogen。PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)和TB Green Premix Ex Taq(Tli RNaseH Plus)购自Takara。细胞裂解液RIPA和BCA蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天。PVDF膜购自美国Millipore。抗URG4抗体和抗ACTB抗体购自德国Sigma。抗E-cadherin抗体和抗TGF-β1抗体购自Abcam。辣根过氧化物酶偶联的抗兔IgG抗体购自赛维尔。ECL检测试剂盒购自赛默飞。

1.2 研究方法

1.2.1 细胞培养及处理：在含10% FBS的DMEM培养基中加入Hep3B细胞，培养48小时。使用LipofectamineTM 3 000试剂将siUGR4和siNC分别转染至Hep3B细胞，转染24 h 后进行迁移、侵袭实验；收集转染48 h 的Hep3B细胞，分别进行定量PCR和Western blotting检测。

1.2.2 定量PCR：按照试剂说明书，使用TRIzol试剂分别将各组细胞中的总RNA样本进行抽提。提取的RNA用不含RNase的DNase预处理后，取2 μg RNA进行cDNA合成和定量PCR。PCR步骤为:①95℃变性，10 min；② 95 ℃变性，15 s；③ 60 ℃退火，60 min；④ 65 ℃引物延伸，5 s，循环44次。每个样品进行3次分析，并使用ACTB基因表达水平为内参。使用2-ΔΔCt的方法对基因相对表达水平进行计算。

ACTB上游引物:5′CCTGACTGACTACCTCATGAAGATCCTC 3′,下游引物:5′ CGTAGCACAGCTTCTCCTTAATGTCAC 3′。URG4上游引物:5′GATACGCCAGTGAACCCCTTAGAC 3′,下游引物:5′CAGCAGAAATGTATGGTAGTGGTTCTC 3′。

1.2.3 细胞迁移和侵袭检测：通过划痕试验测定细胞的迁移能力。24孔板中分别接种表达对照siRNA、siURG4的Hep3B细胞约5×105个，培养至融合度大于90%。融合细胞生长到单层状态时，在其表面使用无菌枪头轻柔地快速划痕，间隔24小时开始观察细胞迁移状态。使用Transwell(6.5 mm，康宁)评估细胞侵袭性。将细胞悬液吹打混匀后，加入200 μl含 5%FBS。调整细胞数为(1×105细胞/cm3)并接种于预先使用基质胶包埋的Transwell小室的内室中，然后在下腔室中加入20%FBS的完全培养基500 μl。37 ℃，24 h。无水甲醛固定发生侵袭的细胞，然后进行结晶紫染色。随机在显微镜下挑选5个视野，细胞计数器下完成侵袭细胞的计数。

1.2.4 Western blotting:分别收集2组转染后的细胞，使用预冷的PBS洗涤三遍清除细胞碎片，加入含蛋白酶抑制剂PMSF的细胞裂解液RIPA。冰浴，30 min 裂解并使用BCA蛋白浓度测定试剂盒对总蛋白进行定量。6%SDS-聚丙烯酰胺凝胶上进行蛋白质样品的分离(20 μg)，然后转膜至PVDF膜上。将 TBST(含0.1%Tween-20)缓冲液配制好的5%脱脂奶粉加入PVDF膜中，室温下封闭1 h。分别将膜与抗URG4抗体(1∶1 000)，抗E-cadherin抗体(1∶1 000),抗TGF-β1抗体(1∶500)和 抗ACTB抗体(1∶1 000)在4 ℃孵育过夜。使用辣根过氧化物酶偶联的抗兔IgG抗体(1∶5 000)和化学增强发光检测试剂盒可视化目的蛋白条带。使用图像处理软件ImageJ(National Institutes of Health开发)对蛋白条带进行灰度分析。以目的蛋白的灰度值除以内参ACTB的灰度值得到的比值表示目的蛋白相对含量。

2 结果

2.1 siURG4显著降低Hep3B细胞内URG4表达水平：定量PCR结果显示，与siNC组相比，siURG4组细胞内URG4 mRNA明显降低(0.431±0.060与0.982±0.026,t=14.64,P<0.05)；Western blotting结果显示，siURG4组细胞内URG4蛋白水平同样出现下调，显著低于siNC组(0.177±0.041与0.948±0.094,t=12.99,P<0.05)。

2.2 敲降URG4基因对于Hep3B细胞迁移、侵袭能力的影响：细胞划痕实验结果显示，siNC组和siURG4组细胞24 h 迁移率分别为(71.2±4.5)%和(53.3±6.4)%，siURG4组细胞迁移能力显著低于siNC组(t=3.975,P<0.05)。同样，Transwell侵袭实验结果显示，siNC组和siURG4组细胞24 h 穿膜细胞数分别为197.8±22.64和131.2±18.1，2组间差异有统计学意义(t=5.137,P<0.05)，见图1(目录后)。

2.3 敲降URG4对Hep3B细胞内TGF-β和E-cadherin表达的影响：Western blotting结果显示，与siNC组相比，siURG4组细胞内TGF-β蛋白水平明显下降 (0.106±0.029与1.333±0.163,t=12.85,P<0.05)，而E-cadherin蛋白水平则明显上升(0.904±0.082与0.664±0.086,t=3.514,P<0.05)。表明UGR4的表达可影响TGF-β和E-cadherin表达。

3 讨论

近年来的数据表明，肝癌的发病率和病死率长期位居我国恶性肿瘤前列[7]。研究表明肝癌细胞具有较强的侵袭能力、易发生转移以及复发的特性与高病死率显著相关。肿瘤发生转移是一个连续的过程，包括肿瘤细胞之间黏附能力减弱、运动能力增强、侵润局部组织、 随血管迁徙并定植在远处器官，而EMT是使肿瘤细胞具有侵袭性非常重要的因素[8]。TGF-β是目前研究EMT发生、发展较为透彻的信号传递通路之一。URG4基因位于人类7号染色体(7p13)，其不同亚型编码有不同的蛋白质[9]。研究表明,高表达的URG4蛋白被发现在许多实体肿瘤，并调控肿瘤的发生以及肿瘤的发展,包括肝细胞癌[10]、胃癌[4]、卵巢癌[11]、胶质母细胞瘤[9]、乳腺癌[5]和非小细胞肺癌[12]。URG4基因在肝癌细胞与临床肝癌组织中的过度表达与细胞的增殖、迁移能力相关。目前在肝癌发生发展过程中，癌基因URG4的作用机制研究较少。本研究通过RNA干扰技术敲降肝癌细胞系Hep3B细胞内URG4表达水平后，Hep3B细胞迁移率和24 h 穿膜数明显降低，可能通过降低肝癌细胞运动能力，从而抑制了Hep3B细胞迁移、侵袭能力。同时敲降肝癌细胞系Hep3B细胞内URG4表达水平后，改变了TGF-β和E-cadherin蛋白的表达水平，与之前的研究结果一致。TGF-β是一个具有多种功能的细胞因子，能够诱导细胞完成 EMT，并且上调肿瘤细胞的侵袭、转移。研究表明，TGF-β既可以活化Smad2 /3形成Smad2 /3 /4 /复合物，经PI3K/Akt 通路介导调控EMT的发生；也可以协同与胞外基质蛋白层黏连蛋白laminin和LN-5，下调E-cadherin表达，诱导肝癌发生EMT[13]。这表明URG4在肝癌中的功能发挥可能与KF-κB通路和TGF-β相关[6,14]。

综上所述，Hep3B细胞内URG4基因表达的多少与细胞迁移，侵袭能力相关。URG4调控细胞迁移侵袭过程涉及TGF-β和E-cadherin蛋白。然而目前关于URG4与TGF-β和E-cadherin蛋白之间的具体作用方式仍不清楚，具体的调节方式还需进一步研究证实。