建兰萼片色素成分初步分析

2021-12-23郑清冬汪艳王艺马山虎艾叶

热带作物学报 2021年11期

郑清冬汪艳王艺马山虎艾叶

摘要：为了解建兰花色多样性及其形成机理，对58个建兰品种的萼片进行了颜色表型分析和色素成分初步分析。结合目测分析、比色卡比色以及色差仪测色，将58个建兰品种的萼片分为4大色系，分别为紫红色系、红色系、黄绿色系和白色系。选择各色系的代表品种进行显色反应、类黄酮特征颜色反应和紫外-可见光谱扫描，分析不同花色系的建兰萼片中含有的色素成分。结果表明：白色系萼片中色素成分较为单一，不含叶绿素和类胡萝卜素，有黄酮类化合物存在;紫红色系和红色系的萼片所含的主要色素成分为类黄酮化合物和花色素苷;黄绿色系萼片所含色素种类最多，包括叶绿素、类胡萝卜素和黄酮类化合物等。该试验为建兰花色素成分的进一步研究以及建兰花色的形成机理奠定了理論基础，同时为建兰色花品种培育提供了参考。

关键词：建兰;花色素苷;类胡萝卜素;类黄酮;叶绿素

中图分类号：S682.31 文献标识码：

Abstract： In order to understand the flower color diversity of C. ensifolium and its formation mechanism， this paper carried out flower color phenotype analysis and preliminary analysis of anthocyanin components on the sepals of 58 C. ensifolium varieties. Combined with visual analysis， colorimetric colorimetry and colorimeter test， the sepals of 58 C. ensifolium varieties were divided into four major colors， purple-red， red， yellow-green， and white. Representative varieties of each color were selected to perform color reaction， characteristic color response of flavonoids and ultraviolet-visible spectrum scanning， and analyze the pigment components contained in the sepals of different flower color. The results showed that the pigment components in the white sepals were relatively simple， without chlorophyll and carotenoids， and flavones existed; the main pigment components in the purple-red and red sepals were flavonoids and anthocyanins; the yellow-green sepals contain the most types of pigments， including chlorophyll， carotenoids and flavones. This experiment would lay a theoretical foundation for the further study of the pigment composition of C. ensifolium and the formation mechanism of the flower color of C. ensifolium， and provided a reference for the cultivation of colorful varieties of C. ensifolium.

Keywords： Cymbidium ensifolium; anthocyanin; carotenoids; flavonoids; chlorophyll

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.11.023

兰科是世界上最大的开花科植物之一，统称兰花，约有6个亚科，900多属，27 000多种[1-2]。其中建兰是兰科兰属多年生草本植物，主要分布于我国福建、浙江、安徽、江西、四川、云南等地，国外主要分布于东南亚各国，以及印度和日本[3]。建兰在我国栽培历史悠久，品系种类繁多，观赏价值高，花型奇特，叶艺和株艺丰富，还具有黄绿色、红色、白色等多种丰富的花色类型，深受广大消费者的喜爱。花色的表现主要由色素成分调控，使植物花器官呈现出各种各样的颜色[4]。

截止目前，有关兰科植物的花色素成分研究已取得了一些进展，Chiou等[5]的研究表明，文心兰中含有类胡萝卜素和类黄酮两类色素。肖文芳等[6]通过对4种不同树兰色素成分进行分析发现，杂交树兰的色素组成包括类黄酮和类胡萝卜素两大类。李崇晖等[7]利用超高效液相色谱分析了蝴蝶石斛兰品种花朵中的类黄酮组成，共鉴定了28种矢车菊素糖苷和19种黄酮醇苷（山奈酚、槲皮素和异鼠李素糖苷）。同样利用超高效液相色谱技术，对四川独蒜兰的花色成分进行分析，结果表明其花色素包括矢车菊素和飞燕草素[8]。此外，类黄酮和类胡萝卜素的种类和含量不同也会造成花色的不同。因此研究花器官中含有的色素种类对于研究建兰品种花色多样性具有重要意义，但目前关于建兰花色形成的研究较少，建兰花色育种进程缓慢，因此本研究采用特征显色反应等方法对建兰萼片中的色素成分进行分析，以期为阐明建兰花色形成机理奠定基础，并为建兰色花新品种的培育提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

试验材料为58个建兰品种（表1），分别收集于福州市森林公园开心兰场、福州市于山风景区兰圃、福州市温泉路紫荆花园小区、龙岩市连城兰花股份有限公司和福州市马尾区马江兰场，采集不同品种盛花期花朵进行分析。先观察植株总体生长情况，选择自然生长状态下长势良好的植株。从不同单株上选择花朵，尽可能提高试验材料的代表性。观测花朵统一选取每一单株花序上的第三朵花。

1.2 方法

1.2.1 建兰萼片颜色表型分析（1）目视测色法。本试验选择建兰萼片的中部作为观察点。将花朵解剖，把待测样品萼片分别放在白纸上，观察者距离待测样品20～30 cm的距离，保持与水平方向45°角观测。并且以5个观测者的观测结果来确定花色，并做好详细记录。

（2）比色卡测色法。采用英国皇家园艺学会标准色谱比色卡（royal horticultural society colour chart，简称RHSCC），测量时间为10：00—16：00，且避开太阳光的直射。将待测样品对准色卡圆孔，认真比较样品颜色与色卡颜色，做好记录。

（3）仪器测色法。本次试验使用杭州彩谱精密色差仪CS-220测量建兰萼片的颜色，每一个品种取5个单株，选取每一单株花序上的第三朵花进行解剖，取萼片作为试验样品，每个试验样品重复测量5次，取其平均值[9]。分别测量亮度L*和2个色彩成分a*值（绿色到红色的范围）和b*（蓝色到黄色范围），运用国际照明委员会（International Commission on Illumination，CIE）色彩系统进行测量结果分析。L*的值域从0到100上升時，亮度会逐渐增加;a*值从–128升至+127表示绿色减弱，红色增强;b*值从–128升至+127则表示蓝色成分逐渐减少，黄色逐渐增加。色度C*的计算公式为C*=（a*2+b*2）1/2，色度角的计算公式为h=arctan（b*/a*）[10]。

运用SPSS（IBM Spss Statistics 20.0）统计分析软件对58个建兰品种的萼片L*、a*、b*值进行聚类分析，运用Microsoft Excel 2013软件进行数据分析。

1.2.2 建兰萼片色素成分定性分析基于萼片颜色表型测量的结果，从白色系、紫红色系、红色系和黄绿色系中选出其代表品种（表2）。分别取不同色系代表品种的萼片置于50 ℃～60 ℃烘箱中烘干，迅速研磨成粉末后放在牛皮纸袋中干燥避光保存[9]，作为盐酸、氨水和石油醚的显色反应、类黄酮特征颜色反应和紫外-可见光谱扫描分析的试验材料，用于建兰萼片色素的定性分析。

（1）显色反应。称取0.1 g粉末放入具塞试管中，分别加入石油醚、10.0%盐酸和30.0%氨水约5 mL，震荡均匀后过滤，观察颜色变化并记录[10-14]。

（2）类黄酮的特征颜色反应。取不同品种的萼片粉末各0.1 g，分别用盐酸化甲醇溶液V （HCl）∶V（MeOH）=1∶99提取15 h，过滤，定容至25 mL，各取2 mL提取液，进行一系列显色反应，观察颜色变化[15-16]。

（3）紫外-可见光谱分析。①萼片中叶绿素的检测。取建兰萼片粉末0.1 g放入具塞试管，用V（丙酮）∶V（乙醇）=9∶1提取，定容到5 mL。在常温避光条件下提取24 h，用北京谱析通用公司生产的TU-1901型紫外可见分光光度计扫描，波长范围设置为400～700 nm，使用光径为1 cm的比色皿[10， 17]。

②萼片中类胡萝卜素的检测。取建兰萼片粉末0.1 g置于具塞试管中，用V（石油醚）∶V（丙酮）=1∶1提取液，定容至10 mL，提取24 h，要求常温避光环境，在200～700 nm波长范围内扫描[10， 17]。

③萼片中类黄酮的检测。取建兰萼片粉末0.1 g放入具塞试管，白色系和黄绿色系加入盐酸化甲醇（pH=3）2 mL置于常温下提取24 h;红色系、紫红色系、加V（HCl）∶V（MeOH）=1∶99的提取液2 mL，定容至10 mL，放在常温（约25 ℃）避光提取24 h，在220～600 nm波长范围内扫描[10， 17-18]。

2 结果与分析

2.1 建兰萼片颜色表型多样性分析

根据目测及比色结果，将58个建兰品种分为紫红色系（purple-red group）、红色系（red group）、黄绿色系（yellow-green group）、白色系（white group）（表3）。

根据L*、a*和b*值的测量结果，运用SPSS（IBM Spss Statistics 20.0）进行平均联接（组间）谱系图聚类分析（图1）。在95%置信区间内将建兰58个品种分为5个组群，根据建兰萼片颜色目视测色的结果，这5个组群可以分为黄绿色、浅绿色、紫红色、深红色、桃红色5个色系。

综合目视测色、比色卡比色和SPSS聚类分析结果，最终将58个建兰品种分为紫红色系（purple-red group）、红色系（red group）、黄绿色系（yellow-green group）、白色系（white group）4个色系。‘马江脂玉’属于白色系;‘墨宝’和‘暮山紫’属于紫红色系;‘市长红’‘绿鸟嘴’‘川芸荷’‘‘红一品’‘玉观音’‘大宝岛’‘彩光登’‘猫捧复色’和‘红花’属于红色系;日月潭之恋’‘富山奇蝶’‘玉女素’‘银边大贡’‘白翁’‘柏林梅’‘碧玉’‘彩虹’‘朝阳’‘翠衣’‘大花梅仙’‘大青’‘大唐宫粉’‘峨眉水仙’‘福建水仙素’‘福州荷’‘含玉’‘荷形’‘荷王’‘鹤山彩荷’‘金荷’‘金丝马尾’‘锦旗’‘老种荷仙’‘龙岩素’‘泸州荷仙’‘泸州百合’‘蒙山彩霞’‘南洋’‘萨摩锦’‘四季集圆’‘铁骨素梅’‘铁骨素’‘夏蕊鼎’‘小主水仙’‘盈玉’‘玉荷素’‘蜘蛛瓣’‘青神梅’‘尤溪素’‘醉红妆’‘玉女绣针’‘绿荷三星’‘广西彩荷’‘连城素’和‘青山玉泉’属于黄绿色系。

国际照明委员会色表系统（CIELAB）对建兰萼片测量的三刺激值结果显示，建兰4个色系品种分别集中在紫红色、红色、黄绿色和白色区域（图2）。从黄绿色系到白色，再到红色，最后到紫红色系，a*值从–13.34升至28.06;b*值从17.89降至–8.93。黄绿色系品种分布在黄绿区域，b*值较高，偏黄;白色处于白色区域，a*和b*值均较小;紫红色系a*值很高，红色表现强烈。

2.2 建兰萼片色素类型定性检测结果分析

2.2.1 石油醚、盐酸、氨水的测试结果从各个色系中选出其代表品种（表2），进行建兰萼片色素成分定性分析试验。石油醚、盐酸、氨水的测试结果如表4所示。

由石油醚反应可看出，4个色系品种中白色系‘马江脂玉’以及黄绿色系的‘大青’‘玉女素’呈现无色，说明不含类胡萝卜素;紫红色系‘墨宝’和‘暮山紫’以及红色系的‘市长红’和‘彩虹’出现极淡黄色，说明其类胡萝卜素含量很低;‘绿鸟嘴’‘富山奇蝶’‘青山玉泉’均出现淡黄色，说明其含有类胡萝卜素，且含量比其余几个色系品种略高[12]。

加入盐酸的测试出现不同程度的红色和黄色，‘墨宝’‘暮山紫’‘市长红’‘彩虹’‘绿鸟嘴’‘富山奇蝶’和‘大青’品种中呈现出红色，说明含有花色素苷，其中‘墨宝’和‘暮山紫’出现较深的红色，花色素苷含量较高;‘市长红’‘彩虹’和‘绿鸟嘴’出现粉红色，说明含有少量花色素苷;‘富山奇蝶’和‘大青’出现浅粉红色，含有少量的花色素苷。其余品种出现黄色，则说明其不含花色苷，有黄酮类化合物存在[19]。

在氨水测试中，‘墨宝’和‘暮山紫’呈现深黄色，‘市长红’和‘彩虹’呈現黄棕色，说明其中含有黄酮醇类化合物。‘绿鸟嘴’和‘青山玉泉’ 呈现出黄色，‘马江脂玉’出现极淡黄色，意味着这些品种含有黄酮色素。其余黄绿色系和白色系的品种均出现不同程度的黄绿色，是由类黄酮表现的黄色和花青苷表现的蓝色混合而成[20-21]，说明‘富山奇蝶’‘大青’和‘玉女素’含有类黄酮和花青苷2种色素。

2.2.2 类黄酮的显色反应各个色系代表品种的类黄酮的显色反应测试结果如表5所示。

（1）浓盐酸-镁粉反应。‘富山奇蝶’‘绿鸟嘴’和‘马江脂玉’无色，可能含有橙酮和查尔酮;‘彩虹’‘墨宝’和‘市长红’出现粉红色，则可能含有花色素苷，粉红色深浅不一，说明含量有差异;‘玉女素’和‘青山玉泉’呈现极淡黄色，说明含有黄酮类化合物。

（2）浓盐酸-锌粉反应。‘彩虹’‘墨宝’‘富山奇蝶’‘玉女素’和‘青山玉泉’呈现出淡粉色，说明含有少量花色素苷类化合物，其余均为无色。

（3）醋酸铅反应。多数品种出现粉色或红色沉淀，说明其含有的黄酮类化合物有邻二酚羟基或兼有3-OH，4-酮基或5-OH，同时也说明其不含有橙酮和查耳酮。‘富山奇蝶’‘玉女素’‘青山玉泉’和‘马江脂玉’无色，则意味着其可能含有二氢黄酮和二氢黄酮醇。

（4）三氯化铁反应。多数品种中表现出黄色，说明其色素分子中不含酚羟基，‘马江脂玉’表现出无色，这说明其可能含有黄酮类化合物。

（5）三氯化铝反应。‘富山奇蝶’和‘玉女素’表现出极淡黄色，表明其含有黄酮。‘彩虹’‘墨宝’‘绿鸟嘴’和‘市长红’出现不同程度的红色，说明其可能含有花色素苷，其余品种为无色。

（6）浓硫酸反应。‘墨宝’表现出橙黄色，意

味着含有花色素苷，其余品种出现不同程度的黄色，意味着含有黄酮类化合物或者黄酮。

（7）碳酸钠反应。大部分品种呈现出极淡黄色，通气之后颜色没有变化，说明不含有二氢黄酮醇。

（8）氨性氯化锶反应。除‘墨宝’‘马江脂玉’和‘玉女素’之外，其余品种出现淡绿色和不同程度的黄色，意味着其含有黄酮类化合物。

（9）硼酸反应。均表现为无色，说明其不含有2-羟基查耳酮和5-羟基黄酮。

2.3 建兰萼片色素的紫外-可见光谱测定结果与分析

建兰各个色系代表品种所含色素的紫外-可见光谱测定结果如表6所示。

2.3.1 建兰萼片中叶绿素的检测 ‘彩虹’‘玉女素’‘尤溪素’和‘富山奇蝶’的丙酮乙醇溶液中，在波长430 nm左右出现明显的峰值，则说明含有叶绿素。其中‘彩虹’‘玉女素’和‘尤溪素’在662 nm出现明显峰值，可能为叶绿素a的吸收峰[17]。其余品种则不含叶绿素。

2.3.2 建兰萼片中类胡萝卜素的检测 ‘彩虹’‘绿鸟嘴’‘富山奇蝶’‘青山玉泉’‘墨宝’和‘慕山紫’在类胡萝卜素的紫外光谱特征吸收峰440 nm和470 nm左右均出现峰值，说明这些品种中均含有类胡萝卜素[9]，其中‘青山玉泉’在448 nm的吸收峰与叶黄素的445 nm峰值很接近。

2.3.3 建兰萼片中类黄酮的检测红色系的‘彩虹’‘市长红’和‘绿鸟嘴’以及紫红色系的‘墨宝’和‘慕山紫’在波长530 nm处出现较为明显的峰值，说明含有类黄酮，为花青素特征吸收峰[22]。

3 讨论

3.1 关于聚类分析结果的讨论

基于色差仪测色的聚类分析中，‘墨宝’和‘慕山紫’的a*值很高，所以呈现出紫红色，与目视测色和比色卡比色分类结果一致;白色系的a*值和b*值都处于中间水平，主要受亮度L*值的影响，所以没有被单独归为一类。红色系被聚为深红色和桃红色两类，黄绿色系被聚为黄绿色和浅红色两类，主要是因为聚类分析是基于L*、a*和b*三刺激值，其中亮度L*值的差异，将红色和黄绿色又进一步聚类为两类。在建兰萼片色素成分的定性分析中，亮度对色素种类的判定影响甚微，所以将深红色和桃红色归为红色系一类，黄绿色和浅绿色归为黄绿色系一类。

3.2 目视测色、RHSCC比色与“CIELAB”系统与花色测量

目视测色法是一种比较基础简单而古老的测色方法，不受空间场地限制。比色卡测色的优点是可移动性强，成本低，使用方便。曾有学者对多种测量颜色的比色卡进行研究，认为英国皇家学会色谱标准（royal horticultural society colour chart，RHSCC）十分适合园艺植物的研究[23]，故本试验采用标准比色卡对建兰萼片进行测色，但是比色卡还不够精确。仪器测色是运用色差仪将颜色这一信息转换成数值表达，使颜色具体化、可视化，对建兰萼片颜色的深入剖析很有帮助。而色差仪通光孔大小无法调节，加上建兰萼片大小、宽窄不一，且存在奇花等不规则萼片，故存在有一些品种萼片不能完全遮住色差仪通光孔，需使用两片萼片拼接测色的情况，从而导致其透明度有所改变，数据存在较大误差。由此，比色卡和色差仪的共同使用能让花色测量更具科学性。但是每一种方法都存在难以避免的缺陷，所以试验需要更为详细的描述，结合实验仪器数据综合分析判断，才能对复杂的花色做出精确的判定。比如丽格海棠[24]、菊花[25]、瓜叶菊[26]等花卉确定不同品种花色时均采用目视测色、RHSCC比色和色差仪测色相结合的方式来进行花色分类。本试验使用该种方法，将试验品种分为4个色系，分别为白色系（white group）、紫红色系（purple-red group）、黄绿色系（yellow-green group）、红色系（red group），并从各个色系中选出具有代表性的品种。从建兰萼片颜色分类结果可以看出，建兰白色系和紫红色系品种较少，萼片颜色表现为黄绿色的品种最多，红色次之。

3.3 建兰萼片中的花色素

兰花是我国十大名花之一，建兰具有花香清幽、花期长、叶形挺拔等特点，深受中国乃至世界各地消费者的青睐。其花色丰富多样，所含色素尤为复杂。本次试验，在石油醚显色反应和紫外-可见光谱检测结果中，与兰科植物大红树兰[6]研究结果相同，紫红色系的‘墨宝’‘慕山紫’和红色系的‘市长红’‘彩虹’‘绿鸟嘴’均呈现出了黄色，说明其中含有类胡萝卜素。2个黄绿色系品种‘大青’和‘玉女素’则没有出现明显的特征颜色和特征吸收峰，可能是因为所含类胡萝卜素含量极低，这也与之前李文建等[27]对建兰黄绿色品种‘龙福星蝶’的研究结论相同，均说明了黄绿色花瓣中类胡萝卜的含量较少。此外，已有研究表明，紫红色系和红色系品种均含有花色苷[7]，本试验再次验证了这个结论。相比于其他色系，白色系萼片中色素成分则显得较为单一，白色系的‘马江脂玉’在氨水反应、类黄酮显色反应的浓盐酸-镁粉、浓盐酸-锌粉、三氯化铁、三氯化铝和氯化锶反应的结果一致，均显示含有黄酮类化合物存在，但不含花色素苷，不含叶绿素和类胡萝卜素，这个结论也在白色石斛兰的相关研究中得出[28]。

花色苷中的天竺葵素可以使花色呈现橙色至红色，矢车菊素使花色呈现粉色[29]，紫红色花是天竺葵素和矢车菊素共色效应的结果，共色效应指的是当植物的组织部位存在类黄酮及其它共色素与花色素苷结合在一起的化合物时而产生增色效应，呈现出从紫色到蓝色的色系变化[30]。因此要解析建兰萼片中花色苷的具体结构成分，还需要进一步研究。建兰萼片所含色素种类复杂多样，且不同色素含量的多少也会影响颜色的呈现。本试验对建兰萼片所含色素种类进行了初步判定分析，后期将使用高效液相色谱法、核磁共振和高效液相质谱联用等方法对建兰萼片色素展开深入研究，为建兰花色育种提供理论基础。

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