APP下载

大黄中总鞣质的提取方法研究

2021-12-23黄思洋陈钰沁朱艳玲赵明智付娟姬杨伶俐

昆明学院学报 2021年6期
关键词:容量瓶光度波长

刘 佳,黄思洋,陈钰沁,朱艳玲,赵明智,付娟姬,杨伶俐

(1.昆明医科大学 海源学院,云南 昆明 650101;2.昆药集团血塞通药业股份有限公司,云南 文山 663400; 3.昆明医科大学第一附属医院 科教部,云南 昆明 650000)

大黄(RheumoffcinaleBaill.)的茎、根除去杂质及外皮,切碎,进行干燥后即可药用.大黄有较多的药理作用,富含蒽醌类、蒽酮类、总鞣质等化学成分,具有良好的致泻、止痛、抗肿瘤、抗衰老、解毒等功效,常用于临床治疗[1-2].

许多学者[1-4]对大黄的研究主要集中于蒽醌类化合物,因蒽醌类化合物具有一定的抗菌活性,并有致泻作用.而鞣质是大黄中重要的活性成分之一,别名单宁,相对分子质量为500~3 000,主要分为水解型和缩合型,其中没食子酸和d-儿茶素是鞣质的主要单体成分,具有一定的药理活性[5-6].此外,鞣质是一类结构较复杂的多元酚类化合物,在植物界分布广泛,约70%以上的生药中含有鞣质类化合物[7].研究[8]发现,鞣质化合物数量多、类型广,具有广泛的药理活性.据报道[7,9-13],鞣质具有抗心脑血管疾病、抗高血压、降血脂、降血糖等作用.

鞣质的提取方法主要有超声波辅助提取、微波提取、浸渍法、水煎法、加压提取和超临界流体萃取等,其中:水煎法也称为煎煮法,是一种常见的浸提方法,该方法方便且经济,但对于煎煮时间、浸泡时间等没有一个最佳标准,导致提取的有效成分效果不明显,且杂质较多,水煎液易变质[14].浸渍法是在容器中装入生药粗粉,再利用溶剂(如水和乙醇等)浸渍药材使其活性成分得到溶解.该方法特别适用于提取有效成分易破坏的药材、黏性药材、芳香性药材和非结构化医药产品.此外,浸渍法根据提取温度分为热、温、冷3种方法,按浸渍次数又分为轻和重2种方法.由于该方法操作时间长,且很难完全浸渍出活性成分,因此对于价值高的药材、毒性药材等都不宜采用此方法.而超声波辅助提取法是借助超声波从植物中提取活性成分,其原理是破坏细胞膜,用超声波来连续震荡提取物,使活性成分得到溶解并释放出来,同时产生热量以保持水温,使原料被水溶解.超声波辅助提取法可缩短提取时间,提高活性成分的提取率及原料的使用率.因此,本研究拟采用超声波辅助提取法提取大黄中的总鞣质,并通过单因素实验和正交实验,对提取方法进行探讨,以期筛选出提取大黄中总鞣质的最佳方法.

1 材料与方法

1.1 实验仪器

UV2550紫外可见光光度计(上海美普达仪器有限公司);SI204型电子天平(上海赞维衡器有限公司);AG133型电子天平(深圳市盛美仪器有限公司);SHBIII循环水式多用真空泵(郑州科秦实验设备有限公司);SK2200H超声仪(苏州创惠电子有限公司);Direct-QTM5超纯水仪(上海砾鼎水处理设备有限公司);电热恒温水浴锅(FANAI仪器有限公司);101A3型干燥箱(上海荣计达仪器科技有限公司);JZL型中药粉碎机(广州市赛豪机械有限公司).

1.2 试药和样品

大黄药材(购自北京同仁堂西安市西大街店);没食子酸对照品(上海鼓臣生物技术有限公司);无水碳酸钠、干酪素、乙醇(分析纯,上海阿拉丁生化科技股份有限公司).

1.3 实验方法

1.3.1 提取工艺

称取一定量的大黄药材,粉碎后过筛,再精密称取10.00 g的大黄粉末,放入10 mL容量瓶中,并加入体积分数为60%的乙醇,超声提取60 min,并用乙醇补足,静置过夜,取上清液,得到质量浓度为1 g/mL的生药.

1.3.2 供试品溶液制备

量取1.3.1项下的适量大黄提取液至250 mL的棕色容量瓶中,并加体积分数为60%的乙醇 150 mL,静置过夜,超声处理10 min,冷却并加乙醇稀释至刻度,轻轻摇动容量瓶,使其混合均匀.充分静置后过滤,弃初滤液,精密量取10 mL置于100 mL的容量瓶中,再加入体积分数为60%的乙醇稀释至刻度,轻轻摇晃容量瓶,让其均匀混合,得供试品溶液.

1.3.3 对照品溶液制备

精密称取50 mg的没石子酸对照品,然后置于100 mL容量瓶中,加水稀释至刻度.精密量取该溶液5 mL置于50 mL的棕色容量瓶中,用水稀释至刻度,摇匀,即得.

1.3.4 检测波长选择

取适量的没食子酸对照品置于50 mL的棕色瓶中,加入1 mL的磷钼钨酸试液及20 mL的水,最后用29%碳酸钠溶液定容至刻度,放置阴凉处静置15 min,选择体积分数为60%的乙醇溶液作为参照物,扫描波长范围选定在200~800 nm处,得最大吸收波长为760 nm.

1.3.5 标准曲线制作

分别精密量取1.3.3项下制备的对照品溶液0.5,1.0,2.0,3.0,4.0,5.0 mL置于6个 25 mL 的棕色容量瓶中,然后顺次加入1 mL的磷钼钨酸试液,并分别加入11.5,11.0,10.0,9.0,8.0,7.0 mL的水,再用29%碳酸钠溶液定容至刻度,轻轻摇晃容量瓶,使其混合均匀,最后静置15 min.用空白溶液作参比溶液,测定 760 nm 处的吸光度值.以吸光度值为纵坐标,溶液质量浓度为横坐标,绘制标准曲线.

1.3.6 总鞣质含量的测定

1)总酚含量的测定.将4.0 mL供试品溶液倒进50 mL洁净的棕色量瓶中,采用与1.3.2项下相同方法则可得到各种供试品溶液,在760 nm处测定吸光度值,将吸光度值代人回归方程,通过计算即可得到溶液里的总酚含量.

2)不被吸附多酚含量的测定.在100 mL锥形瓶中加入0.6 g磨成细粉的干酪素和25 mL于1.3.2项下所制备的溶液放入30 ℃恒温水浴锅中 1 h,摇匀,水浴保温后拿出,放冷至室温,混合均匀静置,过滤弃初滤液,精密量取4 mL续滤液,倒入50 mL洁净的棕色量瓶中,使用1.3.4项下方式处理,于 760 nm 波长处测定吸光度值,代入回归方程式,通过计算即可得到不被吸附的多酚含量.

3)总鞣质含量为:总鞣质含量=总酚含量-不被吸附的多酚含量.

2 结果与分析

2.1 方法学考察

2.1.1 精密度考察

精密量取没食子酸对照品溶液,于760 nm波长处,连续6次测定吸光度值.通过计算得到RSD为0.263%,表明仪器的精密度良好.

2.1.2 稳定性考察

取1.3.2项下制备的供试品溶液6份,在 760 nm 波长处,于0,1,2,4,8,12,24 h分别测定吸光度值.通过计算得到RSD为0.216%,表明在24 h内,该样品稳定性良好.

2.1.3 重复性考察

取6个样品,按1.3.2项下制备的供试品溶液,在波长760 nm处测定吸收度值.通过计算得到RSD为0.132%,表明重复性良好.

2.1.4 线性关系考察

根据数据绘制工作曲线,横坐标和纵坐标分别为没食子酸质量浓度(mg/mL)和吸光度值(A),得到回归方程,Y=98.959x-0.011 3(R2=0.999 6),详见图1.

图1 没食子酸工作曲线

2.1.5 加样回收率

精密称取9份已知样品各0.1 g,并分别加入相同质量的没食子酸对照品.根据1.3.2项下制备的供试品溶液,在760 nm波长处测定吸光度值,并计算回收率,得到平均回收率为99.13%,RSD为0.398%,回收率比较高,详见表1.

表1 加样回收率实验结果(n=9)

2.2 单因素实验考察

2.2.1 溶剂体积分数筛选

取5份各8 g的大黄粉末,精密称定.然后分别加入15倍量体积分数为20%,40%,60%,80%,100%的乙醇,超声提取60 min.显色后在波长760 nm处测定吸光度值,结果见表2.

2.2.2 提取时间筛选

分别取5份各8 g的大黄粉末,精密称定.然后再加入15倍量体积分数为60%的乙醇溶液,分别超声提取20,40,60,80,100 min.显色后在波长760 nm处测定其吸光度值,提取时间筛选结果见表3.

表2 溶剂体积分数对总鞣质提取率的影响

表3 提取时间对总鞣质提取率的影响

2.2.3 固液比筛选

取5份各8 g的大黄粉末,精密称定.加入5,10,15,20,25倍体积分数为60%的乙醇溶液,超声提取80 min.显色后在波长760 nm处测定吸光度值,结果见表4.

2.2.4 正交实验

将单因素实验的测定结果进行比对,完成正交实验的设计,详见表5.在实验过程中将其提取率作为指标进行实验,共进行3次,然后对3次测定的数值进行计算,结果见表6[15].

通过极差分析比较,在上述影响因素中,对提取率影响最大的为A,其次为C,影响率最小的是B.因此,最优提取工艺为A2B3C1,换言之,当乙醇体积分数为60%、提取时间为 100 min、溶剂用量为15倍时,大黄中总鞣质的提取率最高.

表4 固液比对总鞣质提取率的影响

表5 因素水平表(n=3)

表6 正交实验结果

为了对提取工艺的可靠性进行验证,使用相同的提取工艺,按照样品制备方法平行制备3 份样品,则得到平均提取率为1.395%,说明本提取工艺稳定、可靠,可用于大黄中总鞣质的提取.

3 小结

本研究使用乙醇为溶剂,并采用超声波辅助提取法提取大黄中的总鞣质,该方法相较使用溶剂为水的煎煮法、浸渍法、渗漏法等提取方法而言,不仅提取效率明显高于其他方法,而且对有效成分的结构破坏较小,可避免蒽醌类衍生物由于热不稳定性而增加溶出物被破坏的可能性[16-18].

本研究着重对大黄中总鞣质的提取方法进行了探讨,并通过单因素实验探究了溶剂体积分数、提取时间和溶剂用量3个主要因素对于产物提取率的影响,结果表明,当乙醇体积分数为60%、提取时间为100 min、溶剂用量为15倍时,大黄中总鞣质的提取率最高.

猜你喜欢

容量瓶光度波长
一种基于SOM神经网络中药材分类识别系统
一种波长间隔可调谐的四波长光纤激光器
杯中“日出”
谈如何降低容量瓶的容量误差
配制一定物质的量浓度的溶液实验要点剖析
对容量瓶几个实验问题的探讨
乘用车后回复反射器光度性能试验研究
皎皎月光
高中化学实验探究教学设计实践