蒋明星，张 钰，何禧梦，赵云洁，李 翠， 易梦镯，李黎仙，刘 萍，毕晓旭*

(1. 昆明学院 农学与生命科学学院，云南 昆明 650214； 2. 云南白药集团健康产品有限公司，云南 昆明 650214)

龋齿作为口腔最常见的疾病之一，在人群中的发病率一直居高不下．研究[1-2]表明，变异链球菌是引起龋齿的最主要致病菌，其会在牙齿的表面形成牙菌斑生物膜，从而形成一个局部的微生态环境．此外，由于其能够充分利用碳水化合物并代谢为乳酸，且这些酸性物质会在局部环境中持续产生腐蚀牙齿的主要结构物质—磷酸钙[3]．目前，虽然市场上已有针对这类口腔致病菌，且具有显著作用的杀菌剂，但由于其杀菌的广谱型，可能会进一步破坏口腔生态菌群的平衡，以及增加细菌的抗药性[4]和对宿主细胞的细胞毒性[5]．然而，生物酶制剂与这类抑菌化合物相比较，则显得更加安全、有效．

右旋糖酐酶是一种能够裂解高分子右旋糖酐中的α-1,6葡萄糖酐键的水解酶[6]，其变异链球菌生物膜的主要成分是葡聚糖，为生物膜结构的建筑支架．由于右旋糖酐酶能够有效地水解葡聚糖，从而破坏生物膜结构、抑制牙菌斑的形成[7]．而羟基磷灰石(HAP)是一种具有生物活性和生物相容性的材料，其化学组成与人类牙釉质的磷灰石晶体很相似[8]．研究[9-11]表明，羟基磷灰石可以吸附到牙齿表面，促进牙釉质和牙本质表面再矿化，增强釉质的抗龋力．此外，羟基磷灰石具有特殊的孔状结构和表面化学性质，从而具有良好的吸附性能[12]，且对蛋白质也具有较好的吸附作用[13-14]．因此，可尝试利用羟基磷灰石吸附和固定化右旋糖酐酶，以消除牙菌斑生物膜，缓解龋齿．

本文对羟基磷灰石吸附和固定化右旋糖酐酶的方法进行探索，并通过体外模拟变异链球菌生物膜，以及使用吸附右旋糖酐酶的羟基磷灰石进行干预，旨在为生物酶牙膏研发提供一种方法．

1 材料与方法

1.1 材料

右旋糖酐酶(宁夏夏盛实业集团有限公司)；羟基磷灰石和羟基磷灰石圆片(云南白药集团健康产品有限公司惠赠)；葡聚糖T40(源叶生物公司)；异麦芽糖(合肥巴斯夫生物科技有限公司)；TaKaRa BCA Protein Assay Kit(宝生物工程有限公司)；LIVE/DEADTMBacLightTMBacterial Viability Kit(Thermo Fisher 科技公司)；变异链球菌ATCC25175(广东省微生物研究所)．

1.2 仪器

酶标仪(SPECTRA MAX 190)；水浴震荡培养箱(上海一恒)；高速冷冻台式离心机(Eppendorf 5810R)；24孔细胞培养板(Corning-Costar)；厌氧培养罐(日本三菱)；水浴锅(常州国华)；超高分辨共聚焦显微镜(Leica TCS SP8 STED)．

1.3 方法

1.3.1 右旋糖酐酶的吸附和吸附率

称取一定质量的羟基磷灰石置于10 mL离心管中，向其中加入2 mL的右旋糖酐酶溶液(质量浓度为15 mg/mL)，涡旋混匀后将离心管置于37 ℃水浴中100 r/min震荡吸附1，8，16，24 h，随后5 000 r/min离心20 min，将酶液倒入干净的离心管中，用1 mL PBS缓冲液漂洗羟基磷灰石3次，5 000 r/min 离心20 min将上清液转入酶液离心管中，涡旋混匀后，利用BCA法测定其蛋白质量浓度，根据体积计算蛋白质量，计算公式如下：

羟基磷灰石所吸附的蛋白量=总蛋白质量-上清液中蛋白质量；

吸附率=(羟基磷灰石所吸附的蛋白质量/所加入右旋糖酐酶的质量)×100%．

1.3.2 右旋糖酐酶的固定和固定化率

称取100 mg羟基磷灰石置于10 mL离心管中，向其中加入5 mL体积分数分别为0.02%、0.10%、0.20%、0.25%的戊二醛溶液，25 ℃ 100 r/min 震荡交联2 h和8 h．交联结束后，用ddH2O漂洗载体3次，再加入2 mL酶液，37 ℃水浴下，100 r/min震荡交联1 h．

固定化条件优化：称取100 mg羟基磷灰石，首先在5 mL 0.2 mol/L NaOH溶液中40 ℃水浴震荡活化 90 min，活化结束后，用ddH2O漂洗载体3次．再重复上述戊二醛交联实验步骤．固定化率的计算公式如下：

固定化率=(羟基磷灰石所固定的蛋白质量/所加入右旋糖酐酶的质量)×100%．

1.3.3 右旋糖酐酶的吸附和固定化酶活

酶活测定方法：取2%的葡聚糖T40溶液 950 μL，加入吸附或固定化右旋糖酐酶后的羟基磷灰石载体，37 ℃水浴反应30 min后，5 000 r/min离心20 min后取上清液，根据DNS法并参照文献[15]测定酶活．

右旋糖酐酶水解葡聚糖，产物为异麦芽糖．将酶活定义为1 mg羟基磷灰石载体、1 min水解得到1 μmol异麦芽糖的量为1个酶活单位(U)，活力单位为1 U/mg或1 000 U/g．

1.3.4 唾液收集与预处理

唾液收集：选择10名18～30岁的健康志愿者收集其唾液(要求志愿者无吸烟史，在收集前1 h内没有进食、饮水、饮酒等；没有生病、服用药物，尤其1个月内未服用抗生素类药物；3 d内未食用酸奶、益生菌饮料；无龋病、牙周病等口腔疾病患者)，健康成人在进食2 h后用清水漱口，口含棉棒10 min左右，用50 mL离心管收集无刺激性唾液．

唾液预处理：4 ℃ 8 000 r/min离心15 min后取上清液，与PBS等体积混合后，添加终质量分数为0.2%的蔗糖，过滤除菌后分装，保存于 -20 ℃ 备用．

1.3.5 变异链球菌生物膜模拟及干预

变异链球菌生物膜模拟：高压灭菌的羟基磷灰石片置于24孔细胞培养板中(每孔中一个圆盘，圆盘不可接触孔壁)，用上述预处理好的唾液(1.0 mL/孔)37 ℃包衣4 h后，1.0 mL PBS漂洗2次．变异链球菌在37 ℃接种两代至生长对数期，5 000 r/min 离心10 min，弃上清液，PBS洗涤2次，悬浮于1.0 mL预处理的唾液中，37 ℃ 40 r/min 厌氧培养1 h后，置于37 ℃厌氧培养罐中静置培养 24 h 形成生物膜．

羟基磷灰石载体干预：向100 mg吸附右旋糖酐酶的羟基磷灰石载体中加入1.0 mL PBS，悬浮载体后加入模拟好的变异链球菌生物膜羟基磷灰石圆片上，40 r/min厌氧培养1 h后，PBS洗涤2～3次，洗去羟基磷灰石载体．

1.3.6 激光共聚焦显微镜检测生物膜

生物膜样本使用LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kit进行染色，加入1.0 mL PBS后，再加入混合染料2 μL，染色时间为10 min，染色后再用PBS漂洗2～3次，洗去染料．

将羟基磷灰石圆片固定在激光共聚焦显微镜平台上，采用488 nm Ar/Ar-Kr激光共聚焦显微镜进行共聚焦成像．使用40×物镜观察，对羟基磷灰石片上的中间区域5 mm范围进行扫描，选择至少3个独立且具有代表性的位置进行测量，通过图像处理软件TCS SP8 STED 3X量化和表征生物膜的三维结构．

2 结果

2.1 吸附和固定化条件

2.1.1 最佳载体量和吸附时间

为了探索不同量的羟基磷灰石载体在不同时间条件下的最佳吸附效率．固定右旋糖酐酶体积为 2 mL (酶质量浓度为15 mg/mL)，在离心管中分别添加10，50，100 mg羟基磷灰石，在37 ℃水浴中分别吸附1，8，16，24 h，比较不同量的羟基磷灰石在不同时间条件下的吸附率，每个实验重复3次．

实验结果如图1所示，100 mg羟基磷灰石在 2 mL 酶液中吸附1，8，16 h的吸附率均高于 10 mg 和50 mg羟基磷灰石在2 mL酶液中吸附率，并且在1 h时100 mg羟基磷灰石吸附率最高，达到23.9%，随着时间的延长，吸附效率逐渐下降，可能是由于时间延长，羟基磷灰石上吸附的蛋白又出现了脱落．

图1 不同质量的羟基磷灰石在不同时间条件下的吸附率

2.1.2 离子强度对吸附率的影响

研究[16]表明，离子强度的变化会改变羟基磷灰石的ζ电位，从而影响其对蛋白的吸附量．因此，实验中分别添加终浓度为0.05，0.10，0.15，0.20，0.25，0.30 mol/L的NaCl，探索不同离子强度下羟基磷灰石对右旋糖酐酶的吸附率．

图2 不同离子强度下羟基磷灰石对右旋糖酐酶的吸附率

如图2所示，在NaCl终浓度为0.05，0.10，0.15，0.20 mol/L时，吸附率分别为26.6%、25.6%、27.7%和26.8%，均高于直接吸附的最大吸附率23.9%．当NaCl终浓度为0.25，0.30 mol/L 时，吸附率为22.0%和20.6%．这与文献[13～14]报道的一致，离子强度对羟基磷灰石的Zeta电位的影响具有双重性，低浓度的离子强度有利于其形成双电层，增加羟基磷灰石表面的吸附作用，高离子强度又压缩了双电层，从而抑制了羟基磷灰石表面的吸附作用．

2.1.3 戊二醛体积分数和交联时间

戊二醛作为一种广泛使用的蛋白质交联剂，能够使蛋白质紧密的交联在载体上，相比普通的化学吸附，其更加牢固，且不容易脱落[17]．实验中探索了100 mg羟基磷灰石在体积分数分别为0.02%、0.10%、0.20%、0.25%的戊二醛溶液中分别交联2 h和8 h，随后再交联右旋糖酐酶，比较不同体积分数的戊二醛及交联时间对羟基磷灰石固定化右旋糖酐酶效率的影响．

结果如图3所示，羟基磷灰石在不同时间、不同体积分数的戊二醛交联下，对右旋糖酐酶的固定化率影响不大．当戊二醛体积分数为0.02%，交联时间为2 h的固定化率达到最高，为17.6%，而其余体积分数的戊二醛及交联时间下固定化效率则略低于此值，并且最高的固定化率低于直接吸附的吸附率，可能是羟基磷灰石表面的羟基数较少，导致交联上去的蛋白量较低．

2.2 羟基磷灰石吸附和固定化右旋糖酐酶酶活比较

为了进一步比较羟基磷灰石吸附和固定化右旋糖酐酶的效果，对吸附和固定化右旋糖酐酶的羟基磷灰石载体的酶活力进行测定．因为改变离子强度与直接吸附右旋糖酐酶的效率相差不大，所以分别比较了100 mg羟基磷灰石直接吸附法和戊二醛交联法的酶活．

图3 不同体积分数戊二醛及交联时间 下羟基磷灰石对右旋糖酐酶的固定化率

采用直接吸附法，则100 mg羟基磷灰石吸附1 h的酶活力最高，为0.32 U/mg(图4a)．使用戊二醛交联法，不同体积分数的戊二醛、不同时间交联，固定化右旋糖酐酶后的酶活力相差不大，最高为0.35 U/mg，最低为0.33 U/mg(图4b)．

图4 羟基磷灰石吸附和固定化右旋糖酐酶的酶活

2.3 吸附和固定化右旋糖酐酶的载体对生物膜的影响

为了进一步验证吸附和固定化右旋糖酐酶的羟基磷灰石对变异链球菌生物膜的影响，在羟基磷灰石圆片上模拟了变异链球菌生物膜模型，使用吸附和固定化右旋糖酐酶的羟基磷灰石载体对变异链球菌生物膜进行干预．

结果如图5所示，通过激光共聚焦显微镜对羟基磷灰石圆片中5 mm范围内进行扫描，吸附右旋糖酐酶的羟基磷灰石(图5b)和固定化右旋糖酐酶的羟基磷灰石(图5c)与未干预对照组(图5a)相比，生物膜的结构完整性遭到了破坏，生物膜的菌体之间更加稀疏，说明吸附和固定化右旋糖酐酶的羟基磷灰石载体能够有效清除变异链球菌生物膜的完整性．

(a)未干预对照组 (b)吸附右旋糖酐酶的羟基磷灰石 (c)固定化右旋糖酐酶的羟基磷灰石图5 吸附右旋糖酐酶的羟基磷灰石对变异链球菌生物膜的影响

3 讨论

羟基磷灰石对右旋糖酐酶具有较好的吸附效果，最佳吸附比为1∶20(m/V)，吸附时间为1 h，吸附率可达23.9%．通过戊二醛交联进行固定化，固定化率低于吸附率，可能是由于羟基磷灰石表面的羟基数有限，不能固定较多的右旋糖酐酶．

羟基磷灰石对右旋糖酐酶的固定化率低于吸附率，但是固定化酶酶活与直接吸附的酶活相当，可能是通过固定化后，酶活性中心的构象发生了略微变化，导致其更加容易与底物分子接触，从而酶活有所提高．也可能是由于羟基磷灰石载体吸右旋糖酐酶的数量较多，从而压缩了酶的生存空间，其与底物接触的空间位阻增加，因此酶活并未出现显著提高．

右旋糖酐酶通过水解变异链球菌生物膜基质葡聚糖的α-1，6糖苷键，从而破坏生物膜的结构，阻止其在牙齿表面附着[18]．羟基磷灰石可以通过封堵牙小管本质[19]，促进牙釉质表面再矿化，增强釉质的抗龋能力[20]．将羟基磷灰石吸附或固定化右旋糖酐酶后，不仅能增加抗龋力，而且能够显著抑制口腔致龋菌对牙齿的附着，降低牙菌斑，预防龋病和牙周病．研究[7]表明，将具有防龋作用的NaF和右旋糖酐酶联合使用也能显著抑制变异链球菌生物膜的形成．羟基磷灰石与氟化钠的再矿化和预防脱矿作用并没有显著差别[21-22]，但是NaF不能吸附或固定化右旋糖酐酶，而羟基磷灰石由于具有多孔性质，不仅能吸附或固定化右旋糖酐酶，而且具有一定的缓释性能，能够保证右旋糖酐酶持续发挥作用[23]．

目前，牙膏中应用较多的生物酶主要为溶菌酶、葡聚糖酶和右旋糖酐酶等． 溶菌酶通过水解细菌细胞壁，从而抑制致病菌；葡聚糖酶通过切断α-1，6糖苷键来分解牙菌斑．将葡聚糖酶添加到牙膏中能够较好地去除牙菌斑[24]，如溶菌酶牙膏能有效地抑制口腔致病菌[25]，海藻酸钠微球包埋右旋糖酐酶能有效地抑制变异链球菌生物膜的形成[26]．通过在牙膏中添加复合酶和功效成分，可以使其具有多重功效，如FE生物酶复合牙膏，同时添加了溶菌酶、蛋白水解酶和氯化锶，不仅能增强抑菌作用，还具有抗牙本质敏感作用[27]．隆力奇DL复合酶牙膏，同时添加了溶菌酶和葡聚糖酶，不仅能够降低变异链球菌的粘附性，还能有效抑制伴放线杆菌、牙龈卟啉单胞菌和黏性放线菌[28]．

吸附和固定化右旋糖酐酶的羟基磷灰石载体都能够较好地消除变异链球菌生物膜的完整性，这将为更好地消除牙菌斑生物膜、促进牙釉质和牙本质再矿化、提高釉质的抗龋力提供一种可行的方法．但是，目前仅做了单一酶的吸附和固定化，后续工作还将尝试使用多种酶，以期赋予其更多的功效．