刘开湘 （广东省大埔县大麻中学 广东梅州 514299）

灵芝是一种珍贵药材，被古人誉为“仙草”，具有补气益血、养心、安神、利关节、止咳平喘等功效。现代认为，灵芝孢子粉有抗癌作用，药效为灵芝的75 倍［1］。人教版选修1 开设了“微生物的实验室培养”的专题实验，为了培养学生学习微生物学知识的兴趣，笔者通过灵芝栽培拓展设计实验，让学生在栽培实验中学习微生物菌种及其来源，培养基制备、接种、培养，以及子实体形成、防止污染等微生物学基础知识。

1 基础知识

1.1 培养基配方 灵芝通常生活在腐树或活树木的根部，对木质素、纤维素等有很强的吸收、分解能力。采用木屑、棉籽壳、麦麸、米糠或农作物秸秆作为原料，再补充适量氮源和水配制培养基。培养基原料组成如下：棉籽壳65%，麦麸20%，黄豆粉10%，石膏1%，石灰1%，磷酸二氢钾1%，食盐1%，蔗糖1%化水，总料:水=1∶1.3。不添加杀虫剂 和抗生 素［2］。

1.2 无菌技术 对实验操作的空间、培养室、操作者的衣着和手进行清洁、消毒；对实验器具、接种工具和培养基（袋装培养料）进行常压蒸汽高温消毒；接种等实验操作在酒精灯火焰附近进行。

2 实验操作

2.1 制备木质素培养基 培养基原料按配方比例称量，按先多量、后少量顺序混合，干翻至原料均匀，蔗糖水拌入料中，湿翻几次至料粒均匀、湿水，并紧握培养料有水渗出但不下滴（含水量约60%）。选取长33 cm、宽15 cm 且一侧封口的低压聚乙烯塑料袋，每袋装入搅拌均匀的培养料1.5 kg 左右，装料时要先塞紧4 角，并按外实内松要求装至16 cm 高，用塑料绳扎紧袋口。

2.2 培养基消毒 装好料后要及时消毒，采用常压蒸汽高温消毒。为了消毒彻底，保持培养料在100℃的蒸锅中连续消毒8～9 h。高温消毒结束并冷却至30℃以下时即可接种。

2.3 接种 采购灵芝栽培菌种用于接种。接种时严格执行无菌操作，在接种时双手入箱，用75%酒精擦手后，再用酒精擦洗菌种瓶外壁及接种钩。将接种钩在火焰上方充分灼烧、冷却后打开菌种瓶盖，转动瓶口用酒精灯火焰灭菌，迅速挑取菌种接入料袋中，及时密封袋口。

2.4 发菌 接种前要对培养室的培养环境进行消毒和除虫处理。接种后将菌袋置于培养室，平放在地面上层层堆积。发菌期间保持室温和一定的湿度，白天保持有足够的散射光。经过30 d 左右的培育，菌丝发满整个菌袋。

2.5 出芝 菌丝长满后，用消毒后的刀片在袋口处划开1 个出芝口，培养一定时间后出芝口会有乳白色的灵芝子实体原基形成。此时，保持湿度和通风，让子实体开片。用喷水进一步加大空气相对湿度，并加强通风透气，促使灵芝菌盖快速膨大。

2.6 孢子粉和子实体采收 组织学生进行采集孢子粉和采收子实体。在子实体即将成熟时，指导学生将灭菌后的采集袋罩在灵芝菌盖外，采集袋的袋口扎紧在灵芝菌柄上，在采集袋下部开有一组通气孔，位于灵芝菌盖下方。一段时间后，将采集袋取下，收集采集袋内孢子粉，并用排笔毛刷收集灵芝菌盖上的孢子粉。收集完孢子粉后，采收子实体，指导学生一手按住菌袋，一手握住子实体菌柄慢慢转动，轻轻拔出灵芝。

3 实验结果和分析

3.1 实验结果 本实验是微生物实验室培养的拓展，生物学兴趣小组经过3 个月的实践操作，取得了一定成果，收获子实体30 个，采集子实体生产的孢子粉16.2 g。具体实验结果见表1、图1～图4。

表1 灵芝的实验室培养实验的结果统计表

图1 袋装培养料

图2 出芝

图3 受污染的培养基

图4 收集的孢子粉

3.2 讨论和分析 实验操作中，袋装培养基制作和接种是成功的。但有6 袋培养袋没有出芝，其中4 袋在培养过程中出现了被青霉等杂菌感染的情况。师生讨论和分析认为：学生在制备培养料和接种过程严格按照操作程序进行，设备和培养室消毒得当，制料和接种的灭菌是严谨的。但在发菌过程中，培养料袋的翻动次数不够、发菌时湿度过大等因素造成个别培养基发菌不理想。此外，在划口出芝操作中，个别学生使用的刀片未经严格消毒，导致培养基被青霉等杂菌污染，造成出芝失败。通过实验，学生深刻体会到微生物培养过程中保持培养物纯净和无菌操作的重要性。

实验操作中，对灵芝菌种的来源进行了讨论：接种的菌种是怎样获得的？收集的灵芝孢子粉是否可作为菌种进行接种栽培？师生通过讨论后分析认为：灵芝属于担子菌，孢子是单核的担孢子。在自然条件下，孢子长成单核菌丝，通过两性单核菌丝结合成双核菌丝进行繁殖。人工栽培中，灵芝孢子或单核菌丝不用于作菌种，母种可通过培养单核菌丝结合成双核菌丝或通过子实体组织进行选择培养而获得，母种再经过多次培养，制成大量的原种和栽培种。本实验接种的菌种是灵芝栽培种。

4 实验总结

本节实验操作是教材实验的拓展，从生产实例入手，构建“与社会联系”的教学情境，让学生体验科学技术联系社会［3］。让原本略显枯燥的微生物学实验变得有趣而充满收获的成功感。实验中充分发挥了学生的主动性，让学生通过亲身体验和操作实践，学习培养基的制备、接种和无菌操作等微生物培养的基本技能，在实践中充分掌握“微生物的实验室培养”的核心概念和知识。此外，通过理论联系实际，学生拓展学习了灵芝栽培的菌种形成和灵芝繁殖的相关知识，有效激发了学习微生物学的兴趣。