摘要：在当前新时代背景下，民众对食品安全问题的重视程度不断提升，在此背景影响下，我国科研界也加大了对食品安全检测技术的研力度。黄曲霉毒素（AF）对人体健康存在较强的威胁，因此，研究人员对食品黄曲霉毒素检测技术的研究较为深入。考虑到黄曲霉毒素对人体的危害性以及其存在的广泛性，以往单一的检测技术已经难以满足实际应用需求，因此现阶段针对黄曲霉毒素的检测技术呈现出多元发展趋向，现有技术可分为生物分析法、理化分析法、免疫分析法等几项类别，在实际应用过程中取得了较大成效。基于此，本文以坚果食品为例，分析高效液相色谱法在检测食品中黄曲霉毒素的应用。

关键词：黄曲霉毒素;高效液相色谱法;应用

中图分类号：R155.5

0引言

黄曲霉毒素是一种由黄曲霉及寄生曲霉在聚酮作用影响下产生的有毒次生代谢物，它对人体造成的实际危害包括慢性中毒、生长障碍、癌症等。现阶段，技术人员在对其进行充分研究后，分离并鉴定出12种对人体威胁较大的黄曲霉毒素，存在与谷物、堅果等食品之中。从实际情况分析，黄曲霉毒素的产生菌广泛存在于自然界中，这就导致黄曲霉毒素污染可能产生在食品生产的任意一个环节之中[1]。针对黄曲霉毒素最好的处理方案即是消除污染源，最大程度上避免黄曲霉毒素污染食品。目前国内外研究界已经将食品黄曲霉毒素总量检测技术作为重点研究课题之一。

1高效液相色谱法原理概述

从本质层面分析，高效液相色谱法的原理为在适当地流动相条件下，利用反相C18色谱柱对经过净化的样品黄曲霉毒素总量进行分离操作，随后针对黄曲霉毒素所具备的荧光特性，采用荧光检测器对其进行定性以及定量检测。西方研究者者RAO等在1973年建立高效液相色谱法，该方法的优势在于可以同时针对B1、B2、G1、G2这四种黄曲霉毒素进行检测，检测量可以达到1μg/kg。研究界在他们的研究成果上不断进行深化，发展出正相以及反相液相色谱法两种类别，其中反相色谱检测法在灵敏性以及稳定性方面具备更强的优势，但也存在一定的短板，实际检测过程中可以有效针对B2、G2进行检测，但B1、G1在含水溶剂中，其荧光出现淬灭的几率较大，进而导致无法有效检测，因此实际进行过程中需要进行柱前或是柱后衍生，易达成增强分子荧光强度的目的。

高效液相色谱法的优势在于分辨率高，灵敏性强，实际应用过程中可以有效保障检测结果的可靠性，同时可以利用信息系统实现自动化操作，适用于对大批量样品进行定性、定量以及多元分析，现阶段该方法是当前国内外食品黄曲霉毒素总量检测的权威方法[2]。但是该方法同样具备一定短板，即对精密设备要求较高且价格昂贵，对检测人员的技术水平具有较高要求，同时样本需要进行前处理，无法应用于需要进行快速、现场检测的场合。

2食品黄曲霉毒素总量检测条件概述

本文所研究的技术为针对坚果食品黄曲霉毒素总量检测的免疫亲和柱净化高效液相色谱法，试验中应用的色谱仪设备以及荧光检测设备为日本HITACHI公司产品;高速匀质器性能为18000～22000r/min，采用Warning公司产品;6位泵流操作架以及光化学柱衍生器采用国产设备，由北京中检健康技术有限公司生产;C-18柱采用美国clover公司生产设备。

试验所用试剂主要包括黄曲霉毒素总量免疫亲和柱以及黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2标准品两种，分别为北京中检健康技术有限公司以及美国supeleco公司产品。

本次试验中主要针对色谱柱、流动相以及流速等条件进行设置。试验中所用色谱柱规格为4.6mm×150mm，5μg;流动相设置为甲醇—水，二者之间的比例为45：55;试验流速设定为0.8mL/min。本次试验过程中对荧光检测器激发波长以及发射波长进行设置，标准分别为360nm以及440nm[3]。进样体积控制在20～100μL区间范围内。

3检测试验过程

本次试验的目的为利用免疫亲和柱净化高效液相色谱法对坚果食品黄曲霉毒素总量进行检测，在实际试验过程中需要首先对黄曲霉毒素标准品进行配置并构建标准曲线。在操作过程中将B1、B2、G1、G2进行混合配置并将其浓度调配为2600μg/L。其中B1、G1以及B2、G2的浓度存在差异，分别为1000μg/L以及300μg/L。随后试验人员利用流动相对标准品进行配置，混合标准品的质量浓度依次为2.6、13、26、52、104μg/L，随后将其注入至液相色谱检测仪中，并针对B1、B2、G1、G2分别建立标准曲线。

在完成黄曲霉毒素标准品的配置工作后，需要对样品进行处理。实际处理过程中需要首先对样品进行磨细处理，确保其粒度控制在2mm以下，随后精准称取50g样品将其至于250ml具塞锥形瓶中，加入氯化钠以及流动相，其规格分别为5g以及100mL，完成此项操作后使用均质器对其进行高速搅拌提取处理，时间控制在2min。随后利用定量滤纸进行过滤，对滤液进行移取处理，移取量应精准控制在10mL，并加入40mL纯水以达成稀释目的，随后利用玻璃纤维滤纸再次进行过滤[5]。

免疫亲和柱应与10mL玻璃注射器相连接，并将其放置在6位泵流操作架之上，随后取10mL样品处理液并将其注入至玻璃注射器之中，利用空气压力泵设备推动溶液以1滴/s的流速通过免疫亲和柱，2～3mL空气通过柱体即可关闭压力泵。用10mL纯水对柱体进行淋洗处理，反复操作两次并确保全部流出液均已弃流，随后再次推动2～3mL空气通过柱体。之后取2mL色谱级甲醇开展洗脱处理，此过程中应注意将流速控制在1滴/s，同时应对洗脱液进行收集并进行混匀处理，随后注入高效液相色谱仪进行检测。

样品处理步骤完成后，即可开展添加回收实验。试验中选择花生、核桃、腰果作为样品开展试验，分别对不同样品添加B1、B2、G1、G2混合标准品，质量分数梯度设定为5.2，26，52μg/kg，不同梯度应分别进行5组平行试验，随后对回收率以及精密度进行计算。

4检测试验结果分析

4.1光化学衍生器衍生成效

在实际开展本次试验过程中充分认识到B1、G1在遇水后其荧光产生淬灭的几率较大，进而出现液相色谱检测法失效的情况，因此，决定采用光化学衍生提升B1、G1荧光性的方式，极大地提升了检测灵敏性以及有效性。从实际结果分析，在26μg/L质量浓度条件下，经过光化学衍生加强后B1、G1荧光性得到显著增强。图1中（a）与（b）分别为26μg/L质量浓度条件下未经光化学衍生增强以及经过光化学衍生增强的色谱图。

4.2标准曲线

本文所研究试验中，配置了2.6、13、26、52、104μg/L质量浓度的黃曲霉毒素混合标准品，将其分别注入液相色谱检测后，针对B1、B2、G1、G2分别建立标准曲线。从最终结果分析可知，B1、B2、G1、G2四种标准品质量浓度及其峰面积之间呈现出较好的线性关系。表1为黄曲霉毒素混合标准现行回归方程。

4.3样品添加回收率及精密度

本文所研究试验选取花生、核桃、腰果作为样品开展黄曲霉毒素总量检测试验，试验过程中分别在样品中添加不同质量浓度的混合标准品，分别为5.2、26以及52μg/kg，最终测定结果如下：花生样品的回收率以及精密度区间范围分别为85%～94.5%以及2.98%～6.54%;核桃样品的回收率以及精密度区间范围分别为83.2%～94.2%以及1.65%～6.32%;花生样品的回收率以及精密度区间范围分别为81.3%～96%以及3.54%～6.13%[6]。

样品中测定的B1、B2、G1、G2加标回收率以及精密度结果如表2所示。

依据试验结果可知，在10倍信噪比计算定量限条件下，确定黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的方法灵敏度，分别为0.1μg/kg、0.05μg/kg、0.1μg/kg、0.15μg/kg。

以花生样品为例，其在添加质量浓度为26μg/L的黄曲霉毒素标品后测得的色谱图如图1所示。

5总结

综上所述，本文所研究的免疫亲和柱净化—高效液相色谱法在检测黄曲霉毒素过程中具备操作简便的优势，同时净化过程也取得了预期成效。运用光化学衍生方式提升黄曲霉毒素B1、G1的荧光性后，该方法的检测有效性得到了极大的提高。在1.0～40.0μg/L（B1，G1）以及0.3～12.0μg/L（G1，G2）线性范围内，所得回归方程的相关系数均大于0.9999。经过实际检测后，可以得出样品的回收率控制在81.3%～96.0%范围内以及精密度小于10%的结论，同时，试验数据表明其灵敏度很高。本方法试剂用量少、准确度高、灵敏度高，可以有效应用于坚果食品中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2总含量的检测。

参考文献

[1]张宏博，靳志敏，高智慧，等.食品中黄曲霉毒素B1检测方法研究[J].食品安全导刊，2019，228（Z1）：70-73.

[2]李颖之.食品中黄曲霉毒素B1检测方法研究[J].大科技，2019，（015）：254-255.

[3]马腾达，王慧玲，周凤霞，等.黄曲霉毒素B1在食品检测中的研究新进展[J].吉林农业，2019，451（10）：81.

[4]吴震，宗婧，李晨曦，等.基于光激化学发光均相免疫检测技术的黄曲霉毒素检测方法研究[J].光学技术，2019，45（001）：117-123.

[5]王亚楠，王晓斐，王自良.食品黄曲霉毒素总量检测方法的研究与应用[J].食品与发酵工业，2018，44（01）：285-290.

[6]张元杰.ELISA法检测煎饼类食品中黄曲霉毒素含量[J].中国农村卫生，2018（10）：12-13.

作者简介：刘扬（1991-），女，辽宁本溪人，工程师，汉族，硕士研究生，毕业于东北农业大学，食品科学专业，主要从事食品质量检验检测工作。