蒋宁宁，王鹏来，袁长永，黄晓峰，蒋常委，刘宗响*，孙铁忠

（1. 徐州医科大学附属徐州口腔医院口腔颌面外科，江苏 徐州 221002；2. 南京大学附属口腔医院病理科，南京 210008）

舌鳞状细胞癌（tongue squamous cell carcinoma,TSCC）是常见的口腔癌。TSCC的转移和浸润是一个复杂的多步骤过程，受多种相关基因调控。肿瘤转移抑制蛋白1（metastasis suppressor 1, MTSS1）是癌转移机制研究时发现的一种新基因[1-2]，与肿瘤发生发展相关。Ki-67是一种存在于肿瘤细胞增殖周期的蛋白质，可以评价恶性肿瘤细胞的增殖活力[3]。MTSS1定位于人类染色体 8q24.1上，编码5.3Kb的转录本，广泛表达于胸腺、脾脏、前列腺、睾丸、子宫、结肠和外周血液等正常组织中，研究[4]指出MTSS1作为支架蛋白可通过不同途径调控肌动蛋白参与各种类型肿瘤的浸润及转移。MMP-9属于基质金属蛋白酶类，主要破坏ECM、降解肿瘤细胞基底膜等。本研究通过检测80例TSCC中MTSS1表达情况及其与Ki-67和MMP-9的相关性，探讨MTSS1的表达水平与TSCC转移及与各临床病理指标的关系。

1 材料与方法

1.1 标本来源

所有标本来自于南京大学附属口腔医院口腔颌面外科，收集2015年6月－2017年6月经外科及病理科确诊切除的TSCC组织80例，癌旁组织20例；患者年龄29～88岁，中位年龄55岁；TSCC组织中有淋巴结转移组34例，无淋巴结转移组46例；高分化组28例，中～低分化组52例；临床分期按UICC（2009）舌癌分类分期方案分为Ⅰ～Ⅱ期组43例，Ⅲ～Ⅳ期组37例；所有标本符合首次手术，住院前未经过放、化疗。

1.2 免疫组织化学染色

采用EnVision免疫组织化学技术检测MTSS1、Ki-67、MMP-9蛋白的表达，兔抗人MTSS1 单克隆抗体、Ki-67兔抗人单克隆抗体及MMP-9鼠抗人单克隆抗体分别购自CST公司、福建迈新公司；EnVision检测试剂盒与DAB显色剂均购自DAKO公司。免疫组化取手术切除癌组织约1 cm处的黏膜做正常对照；PBS替代一抗作阴性对照。

1.3 结果判定

采用二级积分法进行评分，MTSS1、MMP-9以胞质阳性染色多出现淡黄色、棕黄色、棕褐色，高倍镜下随机取5个以上视野，阳性细胞所占比例积分：A，按显色细胞数记分，无阳性细胞为0，5%～25%为1分，26%～ 50%为2分，51%～75%为3分，＞75%为4分；B，按细胞显色深浅记分，无阳性反应细胞为0分，淡黄色显色1分，黄或棕黄色显色2分，褐或棕褐色显色3分。积分数=A×B：0～2为（-），3～5为（+），6～8为（++），9～12为（+++）[2]。Ki-67阳性染色多出现胞核着色，呈棕黄色或棕褐色，高倍镜下随机选10个视野，每个视野计数100个细胞，记录其中阳性细胞数，测定Ki-67标记指标（LI），所选视野中阳性细胞占计数细胞总和＞10为阳性细胞[3]。

1.4 统计学方法

采用SPSS 19.0统计软件对实验数据进行分析。MTSS1蛋白阳性表达情况与临床病理参数的关系均采用阳性率及χ2检验分析。当n≥40，表格中有一个格的理论频数1≤T＜5时，则需用Yates公式进行连续性校正。以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TSCC组织及癌旁正常黏膜中 MTSS1的表达

见表1，表2，图1。

表1 MTSS-1蛋白在癌旁正常舌黏膜及舌鳞癌组织中的表达

表2 MTSS-1的表达与舌鳞癌临床生物学行为的关系

MTSS1蛋白主要显色于细胞质，染色强度为浅黄色到棕褐色不等，在肿瘤细胞中呈片状分布（图1-A，图1-B）。MTSS1蛋白在癌旁正常黏膜中呈现较强或强的阳性反应（图1-C），其表达率与TSCC组织中相比较，差异具有统计学意义（P＜0.05）；MTSS1蛋白的表达与有无淋巴结转移、临床分期高低、MMP-9以及Ki-67表达有关，有淋巴结转移较无淋巴结转移组的表达率显著降低（P＜0.05）；临床Ⅲ～Ⅳ期组较Ⅰ～Ⅱ期组的表达率显著降低（P＜0.001）；MMP-9和Ki-67阳性的表达率显著降低（P＜0.001）；2）MMP-9蛋白主要表达于细胞质及包膜，染色强度为棕黄色或棕褐色，在癌巢边缘处表达较明显（图1-D，图1-E）。MMP-9蛋白在癌旁正常黏膜中呈现较弱的阳性反应（图1-F）；3）Ki-67蛋白主要显色于胞核，染色主要呈棕黄或棕褐色（图1-G、图1-H）。Ki-67蛋白在癌旁正常黏膜中呈现较弱的阳性反应（图1-I）。

3 讨论

在不同来源类型的肿瘤中，MTSS1蛋白的调控机制存在不同的作用。目前有研究表明，MTSS1在胰腺癌[5]、肺鳞癌[6]、胆管癌[7]、急性粒细胞白血病[8]等恶性肿瘤中的表达下调并与淋巴结转移有关；在肝细胞癌[9]、宫颈癌[2]等恶性肿瘤中表达升高。本研究通过检测20例癌旁正常黏膜与80例TSCC组织中MTSS1蛋白表达的情况，结果发现80例TSCC组织中MTSS1蛋白表达量显著低于20例癌旁正常黏膜；34例有淋巴结转移组的蛋白表达量显著低于46例无淋巴结转移组，37例临床Ⅲ～Ⅳ期组显著低于43例临床Ⅰ～Ⅱ期组。提示MTSS1蛋白与TSCC浸润转移有关，MTSS1不但抑制了TSCC的发生，还影响TSCC的侵袭转移过程，MTSS1蛋白与TSCC的恶性生物学行为有关。该结果符合Yan Guo等[10]研究MTSS1在舌鳞癌细胞系中的表达情况。John C. Dawson 等[11]发现MTSS1在头颈部肿瘤细胞早期表达量升高，并且在EGF信号通路中扮演重要角色。

MMP-9活化后通过降解胶原进而破坏细胞基底膜和ECM，从而促进了肿瘤细胞的侵袭及转移[12]。Ki-67能准确地反映细胞的增殖能力，是检测肿瘤增殖活性的有效指标之一[13]。本研究显示，TSCC组织中的MMP-9和Ki-67的表达较高，癌旁组织中的表达较低。因此，提示MMP-9和Ki-67的高表达可能反映了TSCC病变的发生发展程度。

很多学者提出基因协同作用的假设，认为至少有2种或2种以上不同功能且呈激活状态的基因在恶性肿瘤的发展进程中发挥了不同的作用，或者相互配合，或者互相拮抗，从而促进了肿瘤的浸润转移。Nagai等[14]研究胰腺癌细胞系时发现，过度活化的Hh-Gli信号通路通过从基因转录的水平上调节MMP-9的表达进而促进细胞的侵袭转移，而MTSS1蛋白属于SHh-Gli信号通路上的一员，其失活变化可通过激活SHh-Gli信号通路影响肿瘤的恶性进程。本 研 究 显 示，MTSS1和 MMP-9、Ki-67在 80例TSCC组织中的表达呈负相关，推测MTSS1的失活可能激活了SHh-Gli信号通路，进而诱导MMP-9表达升高并且促进TSCC侵袭转移。Ki-67的改变反映了肿瘤细胞的增殖活性，TSCC中MMP-9和Ki-67表达率较高的肿瘤细胞中MTSS1表达率降低，提示MTSS1在TSCC侵袭转移过程中可能起到抑制作用。

综上所述，MTSS1参与了TSCC的侵袭和转移过程，与Ki-67和MMP-9的表达具有一定的相关性，检测MTSS1可作为TSCC发展和转移的诊断学指标之一。