武霁舟，王省

（南京中医药大学基础医学院/转化系统生物学与神经科学研究中心/中医脑病学重点实验室，南京 210023）

自噬广泛存在于真核生物，与各种生理活动和病理变化密切相关[1]。自噬作为促生存机制[2-3]，当细胞内环境稳态改变或机体受到刺激时，能够清除胞内损伤的细胞器，保护细胞免于凋亡和坏死，在维持能量代谢、内环境稳态等方面起着重要作用[4]。细胞自噬还可以引起II型程序性细胞死亡，以清除受损细胞[5]，但过度激活可能导致多种疾病的发生[6]。

α-生育酚是维生素E的一种存在形式，具有很强的抗氧化能力[7-9]。越来越多的研究发现，抗氧化能力和自噬具有一定联系[10-12]。因此，本研究在此基础上，以HT22小鼠海马神经元细胞为研究对象，观察自噬现象，探索α-生育酚对细胞自噬的影响以及可能的分子机制。

1 材料与设备

1.1 细胞

HT22海马细胞由南京中医药大学药学院馈赠。

1.2 药物和试剂

1）α-生育酚（上海元叶生物科技有限公司，批号J01020RA14，BR，纯度50%）；2）抗体LC3-II，p-AMPK，p-mTOR（Cell Signaling Technology公司，批号分别为12753s，2535s，2971s）；3）p62（Sigma公司，货号P0067）；4）RAPA裂解液（碧云天，P0013K）；5）BSA（Biofroxx公司，货号4240GR100）；6）PBS（HyClone，货号SH30256.01）；7）Dulbecco’s Modified Eagle Medium（DMEM，Gibco公司，货号C11995500BT）；8）MTT（BioFroxx公司，货号3580GR001）；9）0.25%Trypsin-EDTA（Gibco，货号25200-056）。

1.3 仪器

1）垂直电泳槽（Bio-RAD，货号041BR11339）；2）超微量生物检测仪（NanoDrop 2000，货号G402）；3）自动化学发光图像分析系统（Tanon-5200，货号13T12NPFLI-1157）；4）高速离心机（Thermo Fisher，货号75002455）。

2 方法

2.1 HT22细胞的培养及实验分组

HT22细胞接种于10%FBS-DMEM完全培养基，于恒温培养箱（37℃，5%CO2，95%空气，饱和湿度）进行培养，1～2 d全量换液，待细胞融合度达70%～80%进行传代。取对数生长期的HT22细胞，接种于6孔/96孔微量培养板，在完全培养基处理24 h后，随机分为4组：1）Control组：1%FBS-DMEM处理24 h；2）C.C组：15 μm compound C处理24 h；3）α-生育酚组：25 μm α-生育酚处理 24 h；……